الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد العلاج الفعال لمورفولوجيا الخلايا العصبية داخل دماغ القوارض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل التشكل الطبيعي والمعامل تجريبيا للخلايا العصبية داخل مناطق مختلفة من دماغ القوارض. تتمتع هذه التقنية بالميزة الرئيسية المتمثلة في زيادة احتمالية تحديد وتصور الخلايا العصبية المصنفة التي يتم احتواؤها بالكامل في عينات نسيجية مفردة.

ابدأ تلطيخ جولجي كوكس عن طريق وضع دماغ فأر جديد في قارورة تلألؤ زجاجية سعة 20 مليلتر تحتوي على 17 مل من محلول جولجي كوكس. يحفظ من الضوء ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 يوما. بمجرد انقضاء فترة الحضانة ، يحمي Cryo الدماغ عن طريق وضعه في 40 مل من السكروز بالتبريد ، ويحتضن في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد الحضانة في السكروز ، يمكن تجميد الدماغ للتخزين طويل الأجل ، أو حظره على الفور للتقسيم كما هو موضح في القسم التالي من الفيديو. في حالة التجميد ، اغمر الدماغ كله في 200 مل من الأيزوبنتان الذي تم تبريده مسبقا على الثلج الجاف. ثم ضع الدماغ المتجمد في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وخزنه في الظلام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

للبدء ، قم بإزالة الدماغ من السكروز. واستخدم شفرة حلاقة لمنعها من التقسيم عن طريق قطع المخيخ ، وترك حافة مسطحة في الطرف الذيلية المتبقية من الدماغ. يجب حظر الدماغ بزاوية دقيقة لضمان احتواء الخلايا العصبية ذات الأهمية بالكامل داخل الأقسام الناتجة.

على سبيل المثال ، نستخدم مستوى إكليلي عمودي تماما على المحور الذيلي المنقاري للخلايا العصبية الهرمية للقشرة الدماغية. بعد ذلك ، سخني أجار حتى يذوب. واتركها تبرد حتى تصل إلى أعلى قليلا من نقطة الانصهار.

ثم ضع الدماغ في طبق وزن صغير يمكن التخلص منه بحيث يكون الطرف الذيلي متجها لأسفل. أضف الأجار المذاب لتغطية الدماغ. بمجرد أن يصلب الأجار ، قم بقص الفائض مع ترك ما يقرب من ملليلتر إلى أربعة ملليلتر يحيط بالدماغ.

ثم استخدم كمية صغيرة من السيانواكريلات الإيثيلي للصق الدماغ بمرحلة الاهتزاز مع نهايته الذيلية ووجهها لأسفل. املأ منطقة المرحلة من الاهتزاز بما يكفي من السكروز بالتبريد لتغطية الدماغ. ثم قم بتقسيم الدماغ بسمك شريحة يتراوح من 400 إلى 500 ميكرون اعتمادا على منطقة الدماغ المراد فحصها.

باستخدام فرشاة رسم صغيرة ، ضع أقسام الدماغ في آبار من صفيحة زراعة أنسجة من ستة آبار تحتوي على إدخالات قاعية شبكية ومملوءة مسبقا بمحلول فوسفات السكروز M. حماية من الضوء أثناء التقسيم. عند الانتهاء من التقسيم ، احتضن الأقسام في الظلام عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

باستخدام إدخالات القاع الشبكية ، انقل أقسام الدماغ إلى بئر جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من بارافورمالدهيد في مخزن الفوسفات. احتضن على هزاز يتحرك بسرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. اغسل الأقسام مرتين عن طريق نقلها إلى آبار جديدة تحتوي على خمسة ملليلتر من الماء.

يحفظ من الضوء ويغسل بسرعة معتدلة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، انقل الأقسام إلى بئر جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من هيدروكسيد الأمونيوم. صخرة ببطء في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

اغسل الأقسام مرتين عن طريق نقلها إلى آبار جديدة تحتوي على خمسة ملليلتر من الماء. اغسل على كرسي هزاز يتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. انقل الأقسام إلى بئر جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من المثبت المخفف A.احتضن على هزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.

اغسل الأقسام بالماء مرتين كما كان من قبل. استخدم فرشاة رسم صغيرة لوضع الأقسام على شريحة مجهرية ، ثم استخدم ملاقط ومنديلا صغيرا لإزالة الماء الزائد والأجار. تأكد من إزالة كل أجار قبل متابعة خطوات التجفيف.

اترك الأقسام تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. وقت التجفيف المناسب أمر بالغ الأهمية ، ويجب تحديده لكل مختبر. قد يؤدي قصر الوقت إلى سقوط الأقسام من الشرائح أثناء خطوات الجفاف ، وقد يؤدي وقت طويل جدا إلى تشقق الأقسام.

بعد التجفيف ، ضع الشرائح أولا في عامل المقاصة لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في 100٪ إيثانول لمدة خمس دقائق. ثم انتقل عبر سلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة لمدة دقيقتين لكل منهما.

بعد سلسلة الكحول ، ضع الشرائح في الماء لمدة خمس دقائق. ثم وصمة عار في 0.5٪ كريسيل البنفسجي في الماء لمدة سبع دقائق. بعد بقعة كريسيل البنفسجي ، ضع الشرائح في الماء لمدة دقيقتين.

ثم قم بتجفيف الأقسام من خلال سلسلة من تركيزات الكحول المتزايدة لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم غسلين في 100٪ إيثانول لمدة خمس دقائق. ضعها في عامل المقاصة لمدة خمس دقائق.

أخيرا ، أضف وسيط تثبيت لا مائي وضع زلة غطاء فوق الأقسام. اترك الشرائح تجف أفقيا في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمسة أيام على الأقل. لالتقاط مجموعات صور عالية الدقة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية ذات الأهمية ، حدد أولا هدف غمر زيت السيليكون 30X 1.05 NA على المجهر.

ثم ضع ثلاث إلى أربع قطرات من زيت الغمر السيليكوني على الشريحة. ضع الهدف فوق الشريحة ، مما يضمن الاتصال بين الهدف والزيت. قم بتركيز الصورة واضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التعريض الضوئي وتوازن اللون الأبيض في برنامج التصوير.

بعد ذلك، قم بتعيين الحدود العلوية والسفلية لحزمة الصور عن طريق التركيز على أعلى القسم، ثم تحديد تعيين بجوار أعلى المكدس داخل نافذة الحصول على الصور. ثم ركز على أسفل القسم ، وحدد تعيين بجوار أسفل المكدس. اضبط مسافة الخطوة على ميكرون واحد عن طريق إدخال ميكرون واحد بجوار المسافة بين الصور داخل نافذة الحصول على الصور.

أخيرا ، التقط مكدس الصور عن طريق تحديد اكتساب مكدس الصور داخل نافذة الحصول على الصور. كرر الخطوات السابقة لالتقاط منطقة الاهتمام بأكملها مع التأكد من تداخل جميع مكدسات الصور بنسبة 10٪ على الأقل في المحورين X و Y. هذه الصورة للقشرة الدماغية عبارة عن إسقاط Z مدمج لمداخن الصور المكتسبة من قسم بسمك 500 ميكرون باستخدام هدف 10X.

تمت معالجة الأنسجة الموجودة في هذه الصورة باستخدام البروتوكول الرئيسي الجديد. تم تصوير المنطقة المشار إليها بالمربع الأحمر باستخدام هدف غمر زيت السيليكون 30X وتم الحصول على مكدس صور إسقاط Z مدمج عالي الدقة. يظهر السهم الأحمر الإسقاط Z ثنائي الأبعاد لخلية عصبية تم تتبعها من مجموعة الصور عالية الدقة 30X.

هنا تم استخدام متغير البروتوكول الجديد مع تلطيخ كريسيل البنفسجي. تظهر هذه الصورة عالية الدقة القسم الملون باللون البنفسجي كريسيل. وهذا هو تتبع الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها.

أخيرا ، تمت معالجة هذا النسيج باستخدام متغير البروتوكول الذي يتم فيه تجميد الأدمغة بعد تشريب جولجي كوكس. هنا تظهر الأنسجة المجمدة مسبقا بدقة أعلى. ومرة أخرى يتم الحصول على إسقاط Z ثنائي الأبعاد عالي الجودة لتتبع الخلايا العصبية.

يمكن إكمال هذه التقنية في غضون شهر واحد مع اكتمال خطوات المعالجة والتصوير خلال الأسبوع الأخير. يمكن بدلا من ذلك تجميد الأدمغة بعد تشريب جولجي كوكس ، مما يسمح بإكمال المعالجة والتصوير في وقت لاحق. بعد هذا الإجراء ، يمكن لعلماء الأعصاب استخدام الصور الملتقطة لإجراء تحليلات مورفولوجية مفصلة مثل تعقيد التغصنات أو كثافة العمود الفقري من أجل تحديد كيف يمكن للتلاعب التجريبي أن يغير بنية الخلايا العصبية داخل الدماغ.