الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس
أبريل 18, 2017
نقدم بروتوكول باستخدام طريقة تلوين جولجي كوكس في أقسام الدماغ سميكة، من أجل رؤية الخلايا العصبية مع أشجار شجيري طويلة الواردة في عينات الأنسجة واحدة. يتم عرض نوعين مختلفين من هذا البروتوكول أيضا التي تنطوي على الكريزيل البنفسجي counterstaining، وتجميد العقول غير المجهزة لتخزين على المدى الطويل.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد العلاج الفعال لمورفولوجيا الخلايا العصبية داخل دماغ القوارض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل التشكل الطبيعي والمعامل تجريبيا للخلايا العصبية داخل مناطق مختلفة من دماغ القوارض. تتمتع هذه التقنية بالميزة الرئيسية المتمثلة في زيادة احتمالية تحديد وتصور الخلايا العصبية المصنفة التي يتم احتواؤها بالكامل في عينات نسيجية مفردة.
ابدأ تلطيخ جولجي كوكس عن طريق وضع دماغ فأر جديد في قارورة تلألؤ زجاجية سعة 20 مليلتر تحتوي على 17 مل من محلول جولجي كوكس. يحفظ من الضوء ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 يوما. بمجرد انقضاء فترة الحضانة ، يحمي Cryo الدماغ عن طريق وضعه في 40 مل من السكروز بالتبريد ، ويحتضن في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
بعد الحضانة في السكروز ، يمكن تجميد الدماغ للتخزين طويل الأجل ، أو حظره على الفور للتقسيم كما هو موضح في القسم التالي من الفيديو. في حالة التجميد ، اغمر الدماغ كله في 200 مل من الأيزوبنتان الذي تم تبريده مسبقا على الثلج الجاف. ثم ضع الدماغ المتجمد في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وخزنه في الظلام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
للبدء ، قم بإزالة الدماغ من السكروز. واستخدم شفرة حلاقة لمنعها من التقسيم عن طريق قطع المخيخ ، وترك حافة مسطحة في الطرف الذيلية المتبقية من الدماغ. يجب حظر الدماغ بزاوية دقيقة لضمان احتواء الخلايا العصبية ذات الأهمية بالكامل داخل الأقسام الناتجة.
على سبيل المثال ، نستخدم مستوى إكليلي عمودي تماما على المحور الذيلي المنقاري للخلايا العصبية الهرمية للقشرة الدماغية. بعد ذلك ، سخني أجار حتى يذوب. واتركها تبرد حتى تصل إلى أعلى قليلا من نقطة الانصهار.
ثم ضع الدماغ في طبق وزن صغير يمكن التخلص منه بحيث يكون الطرف الذيلي متجها لأسفل. أضف الأجار المذاب لتغطية الدماغ. بمجرد أن يصلب الأجار ، قم بقص الفائض مع ترك ما يقرب من ملليلتر إلى أربعة ملليلتر يحيط بالدماغ.
ثم استخدم كمية صغيرة من السيانواكريلات الإيثيلي للصق الدماغ بمرحلة الاهتزاز مع نهايته الذيلية ووجهها لأسفل. املأ منطقة المرحلة من الاهتزاز بما يكفي من السكروز بالتبريد لتغطية الدماغ. ثم قم بتقسيم الدماغ بسمك شريحة يتراوح من 400 إلى 500 ميكرون اعتمادا على منطقة الدماغ المراد فحصها.
باستخدام فرشاة رسم صغيرة ، ضع أقسام الدماغ في آبار من صفيحة زراعة أنسجة من ستة آبار تحتوي على إدخالات قاعية شبكية ومملوءة مسبقا بمحلول فوسفات السكروز M. حماية من الضوء أثناء التقسيم. عند الانتهاء من التقسيم ، احتضن الأقسام في الظلام عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
باستخدام إدخالات القاع الشبكية ، انقل أقسام الدماغ إلى بئر جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من بارافورمالدهيد في مخزن الفوسفات. احتضن على هزاز يتحرك بسرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. اغسل الأقسام مرتين عن طريق نقلها إلى آبار جديدة تحتوي على خمسة ملليلتر من الماء.
يحفظ من الضوء ويغسل بسرعة معتدلة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، انقل الأقسام إلى بئر جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من هيدروكسيد الأمونيوم. صخرة ببطء في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
اغسل الأقسام مرتين عن طريق نقلها إلى آبار جديدة تحتوي على خمسة ملليلتر من الماء. اغسل على كرسي هزاز يتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. انقل الأقسام إلى بئر جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من المثبت المخفف A.احتضن على هزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
اغسل الأقسام بالماء مرتين كما كان من قبل. استخدم فرشاة رسم صغيرة لوضع الأقسام على شريحة مجهرية ، ثم استخدم ملاقط ومنديلا صغيرا لإزالة الماء الزائد والأجار. تأكد من إزالة كل أجار قبل متابعة خطوات التجفيف.
اترك الأقسام تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. وقت التجفيف المناسب أمر بالغ الأهمية ، ويجب تحديده لكل مختبر. قد يؤدي قصر الوقت إلى سقوط الأقسام من الشرائح أثناء خطوات الجفاف ، وقد يؤدي وقت طويل جدا إلى تشقق الأقسام.
بعد التجفيف ، ضع الشرائح أولا في عامل المقاصة لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في 100٪ إيثانول لمدة خمس دقائق. ثم انتقل عبر سلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة لمدة دقيقتين لكل منهما.
بعد سلسلة الكحول ، ضع الشرائح في الماء لمدة خمس دقائق. ثم وصمة عار في 0.5٪ كريسيل البنفسجي في الماء لمدة سبع دقائق. بعد بقعة كريسيل البنفسجي ، ضع الشرائح في الماء لمدة دقيقتين.
ثم قم بتجفيف الأقسام من خلال سلسلة من تركيزات الكحول المتزايدة لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم غسلين في 100٪ إيثانول لمدة خمس دقائق. ضعها في عامل المقاصة لمدة خمس دقائق.
أخيرا ، أضف وسيط تثبيت لا مائي وضع زلة غطاء فوق الأقسام. اترك الشرائح تجف أفقيا في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمسة أيام على الأقل. لالتقاط مجموعات صور عالية الدقة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية ذات الأهمية ، حدد أولا هدف غمر زيت السيليكون 30X 1.05 NA على المجهر.
ثم ضع ثلاث إلى أربع قطرات من زيت الغمر السيليكوني على الشريحة. ضع الهدف فوق الشريحة ، مما يضمن الاتصال بين الهدف والزيت. قم بتركيز الصورة واضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التعريض الضوئي وتوازن اللون الأبيض في برنامج التصوير.
بعد ذلك، قم بتعيين الحدود العلوية والسفلية لحزمة الصور عن طريق التركيز على أعلى القسم، ثم تحديد تعيين بجوار أعلى المكدس داخل نافذة الحصول على الصور. ثم ركز على أسفل القسم ، وحدد تعيين بجوار أسفل المكدس. اضبط مسافة الخطوة على ميكرون واحد عن طريق إدخال ميكرون واحد بجوار المسافة بين الصور داخل نافذة الحصول على الصور.
أخيرا ، التقط مكدس الصور عن طريق تحديد اكتساب مكدس الصور داخل نافذة الحصول على الصور. كرر الخطوات السابقة لالتقاط منطقة الاهتمام بأكملها مع التأكد من تداخل جميع مكدسات الصور بنسبة 10٪ على الأقل في المحورين X و Y. هذه الصورة للقشرة الدماغية عبارة عن إسقاط Z مدمج لمداخن الصور المكتسبة من قسم بسمك 500 ميكرون باستخدام هدف 10X.
تمت معالجة الأنسجة الموجودة في هذه الصورة باستخدام البروتوكول الرئيسي الجديد. تم تصوير المنطقة المشار إليها بالمربع الأحمر باستخدام هدف غمر زيت السيليكون 30X وتم الحصول على مكدس صور إسقاط Z مدمج عالي الدقة. يظهر السهم الأحمر الإسقاط Z ثنائي الأبعاد لخلية عصبية تم تتبعها من مجموعة الصور عالية الدقة 30X.
هنا تم استخدام متغير البروتوكول الجديد مع تلطيخ كريسيل البنفسجي. تظهر هذه الصورة عالية الدقة القسم الملون باللون البنفسجي كريسيل. وهذا هو تتبع الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها.
أخيرا ، تمت معالجة هذا النسيج باستخدام متغير البروتوكول الذي يتم فيه تجميد الأدمغة بعد تشريب جولجي كوكس. هنا تظهر الأنسجة المجمدة مسبقا بدقة أعلى. ومرة أخرى يتم الحصول على إسقاط Z ثنائي الأبعاد عالي الجودة لتتبع الخلايا العصبية.
يمكن إكمال هذه التقنية في غضون شهر واحد مع اكتمال خطوات المعالجة والتصوير خلال الأسبوع الأخير. يمكن بدلا من ذلك تجميد الأدمغة بعد تشريب جولجي كوكس ، مما يسمح بإكمال المعالجة والتصوير في وقت لاحق. بعد هذا الإجراء ، يمكن لعلماء الأعصاب استخدام الصور الملتقطة لإجراء تحليلات مورفولوجية مفصلة مثل تعقيد التغصنات أو كثافة العمود الفقري من أجل تحديد كيف يمكن للتلاعب التجريبي أن يغير بنية الخلايا العصبية داخل الدماغ.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة تلوين جولجي-كوكس لتصور الخلايا العصبية ذات الأشجار التغصنية الطويلة في أقسام الدماغ السميكة. يتضمن المتغيرات مع التلوين المقابل بالفيوليت الكريزيلي وطرق التخزين طويل الأمد للأدمغة غير المعالجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تشريح الأعصاب
- علم الأنسجة
الخلفية
- طريقة تلوين جولجي-كوكس ضرورية لدراسة شكل الخلايا العصبية.
- تسمح بتصور الخلايا العصبية داخل العينات النسيجية المفردة.
- هذه التقنية حاسمة لفهم الهياكل الطبيعية والمتغيرة للخلايا العصبية.
- يتم تسهيل التخزين طويل الأمد لعينات الدماغ بواسطة مواد حماية خاصة من البرد.
غرض الدراسة
- لتقييم شكل الخلايا العصبية في دماغ القوارض.
- للتحقيق في تأثيرات العلاجات المختلفة على بنية الخلايا العصبية.
- لتعزيز تحديد الخلايا العصبية المميزة في العينات النسيجية.
الطرق المستخدمة
- تحضين دماغ الفأر في محلول جولجي-كوكس لمدة 25 يومًا.
- حماية الدماغ من البرد باستخدام سكروز مادّة حماية من البرد.
- تخزين العينات في الظلام عند 4 درجات مئوية.
- تصور الخلايا العصبية بعد التلوين.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح للخلايا العصبية ذات الأشجار التغصنية الطويلة.
- مقارنة شكل الخلايا العصبية تحت ظروف تجريبية مختلفة.
- تحديد محسّن للخلايا العصبية داخل عينات الأنسجة المفردة.
- جدوى التخزين طويل الأمد لعينات الدماغ دون فقدان الجودة.
الاستنتاجات
- طريقة جولجي-كوكس فعالة لدراسة شكل الخلايا العصبية.
- يمكن للمتغيرات من البروتوكول تحسين نتائج التصور.
- تقنيات التخزين طويل الأمد قابلة للتطبيق في البحث المستقبلي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution visualization of neuronal morphology in thick brain sections, supporting mechanistic de-risking in target validation by providing quantitative structural data on dendritic complexity and spine density. It enhances predictive confidence in preclinical models by allowing reliable assessment of treatment-induced morphological changes within intact tissue architecture. The method supports translational continuity from discovery through preclinical stages by generating reproducible, imaging-ready samples suitable for cross-functional collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through detailed morphological analysis of neuron structure in disease-relevant systems.
- Operational Value: Increases probability of identifying fully contained stained neurons within single sections, reducing sampling bias and improving data reliability.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking experimental manipulations to quantifiable changes in dendritic trees and spine density.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, thick-section preparations compatible with high-resolution imaging for consistent morphological readouts.
- Operational Value: Enables assay readiness through cryoprotection and long-term storage options, allowing batch processing and delayed imaging without quality loss.
- Screening Readiness: Facilitates scalable preparation of validated biological systems for downstream compound evaluation in neuropharmacology screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains structural integrity of neuronal networks from discovery through preclinical validation, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Provides direct visualization of subcellular features like dendritic spines, enabling objective assessment of treatment effects on neuronal architecture.
- Biomarker Alignment: Generates quantitative morphological outputs (e.g., spine density, dendritic branching) that can serve as translational biomarkers in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, where morphological endpoints inform lead identification and predictive modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling detailed structural analysis of neurons in defined brain regions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs that allow comparison of neuronal morphology across experimental conditions.
- Analytics: Generates high-resolution image stacks and Z-projections suitable for morphometric analysis, enabling statistical comparison of dendritic complexity and spine density.
- Translational Research: Connects discovery-stage findings to preclinical continuity by preserving tissue integrity for longitudinal analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histology-imaging workflow applicable across multiple neuropharmacology projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, high-resolution visualization of neuronal structure changes following experimental manipulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined section thickness, staining consistency, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering objective morphological data that reduces biological risk in later-stage development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on quantifiable effects on neuronal architecture.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, microtomy, and fluorescence or brightfield microscopy with optical sectioning capability.
- Dependent on specialized equipment including a vibratome for thick sectioning and an upright microscope with long-working-distance high-NA objectives.
- Necessitates cross-team standardization of staining, sectioning, and imaging protocols to ensure consistency across sites or studies.
- Adaptation considerations include adjusting section thickness and staining duration for different brain regions or species while maintaining Golgi-Cox impregnation efficacy.
- Practical limitations include the 25-day incubation period and light sensitivity during processing, which require controlled laboratory environments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:39
Golgi-Cox Impregnation of Brains
1:47
Brain Sectioning
3:34
Developing Brain Sections
5:03
Mounting Brain Sections
6:55
Imaging Stained Neurons within Thick Brain Sections
8:21
Results: Photomicrographs of Stained Neurons in the Anterior Cingluate Area 1
9:44
Conclusion
