واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

الهدف العام لبرنامج تحليل الصور هذا هو التحليل الموازي لديناميكيات النتوء وتركيز البروتين النسبي على طول الأرجل بالكامل. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة حقا في فهم الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلية ، وخاصة البروتينات الفردية المشاركة في تمديد وتراجع الخيط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن خوارزمية تتبع الشكل التكيفية المقدمة ، تسمح بالتقييم الكمي لديناميكيات النتوء وتوطين البروتين الذي تم حله مكانيا.

للبدء ، زراعة الخلايا العصبية ، خلايا HeLa أو COS ، في وسط مكمل كما هو مفصل في بروتوكول النص. بمجرد الوصول إلى التقاء 40٪ ، قم بنقل الخلايا بالتركيبات التي تختارها ، باستخدام كاشف النقل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتفظ بالخلايا المنقولة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 إلى 18 ساعة.

بعد الحضانة ، املأ غرف زراعة الخلايا حتى 90٪ بوسط مسخن مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، يحتوي على 20 ملي من HEPES المولي ، لتقليل التغيرات في الأس الهيدروجيني والأوسمولية بسبب التبخر أثناء الحصول على الصورة. لإغلاق الغطاء ، ضع طبقة رقيقة من الشحوم المفرغة من الهواء على الجزء الداخلي من الغطاء واضغط عليها برفق على غرفة الثقافة التي تحتوي على الخلايا المنقولة. ربما يكون الجزء الأكثر أهمية لتحليل الصور هو جودة الصورة.

شيء واحد يجب أن نحتني به هو نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، والتي يجب أن تكون أكثر من أربعة ويمكننا التأكد من أنه من خلال ضبط وقت التعرض للكاميرا وشدة الليزر وقوته ، يجب أن يكون معدل الإطارات أكثر من هرتز واحد. احصل على الصور باستخدام مجهر بهدف 60x أو 100x وبدون ثني بكسل. استخدم معدلات اكتساب لا تقل عن هرتز واحد لتتبع ديناميكيات الأرجل الخيطية.

لتقليل القطع الأثرية الخارجة عن التركيز ، قم بتصوير خيطية الأرجل بالقرب من غشاء الريحان. لضمان التتبع السلس ، اضبط وقت التعرض للكاميرا وشدة الليزر بحيث تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء أكبر من أربعة. بمجرد اكتمال ذلك ، ابدأ الحصول على الصورة.

بعد المعالجة المسبقة للصورة، كما هو موضح في بروتوكول النص، قم بتحميل الصور عن طريق تنزيل المجلد المضغوط الذي يحتوي على جميع الملفات المطلوبة لتحليل الصور. قم بفك ضغط الملفات ونسخها في مجلد العمل. بمجرد التثبيت ، ابدأ واجهة المستخدم الرسومية عن طريق فتح الملف المسمى filopodiaAnalysisM3.fig.

قم بتحميل ملفات TIFF المكدس المحفوظة للبروتينات الفردية في واجهة المستخدم الرسومية أو واجهة المستخدم الرسومية. باستخدام الأزرار 1B للبروتين A و 1C للبروتين B واختياريا 1D للبروتين C.قم بإنشاء صورة متراكبة للخلية من قنوات البروتين بالنقر فوق 1A. ثم انقر فوق 2A ، لتعيين الإطار الأول وانقر فوق 2B ، لتعيين الإطار الأخير للتحليل.

اختياريا، قم بقص منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار، الذي يحتوي على الوقود محل الاهتمام باستخدام الزر 2H. قم بتدوير الصورة باستخدام الزر 2I ، أو احذف المناطق غير المرغوب فيها باستخدام أداة الرسم باليد الحرة ، 2J. حرك شريط التمرير ، 2C لكل إطار لمراقبة الجودة والتحقق مما إذا كان الخيط يظل مرئيا بوضوح طوال الفيلم بأكمله.

لإنشاء التتبع ، انقر أولا فوق الزر 3A في نافذة واجهة المستخدم الرسومية الأولى ، لفتح نافذة واجهة المستخدم الرسومية الثانية. انقر فوق الزر الأربعة في نافذة واجهة المستخدم الرسومية الثانية ، لإنشاء كتلة جسم الخلية المتراكبة التي تم إنشاؤها في نافذة واجهة المستخدم الرسومية الأولى ، بعد النقر فوق 1A. نوصي بقضاء بعض الوقت في تحسين المعلمات مثل عدد المقاطع وعرض المسح ونصف قطر الفحص لمجموعة البيانات التجريبية.

حرك شريط التمرير في النافذة رقم اثنين، للتحقق من مكان ظهور الطرف العرضي لأول مرة. ثم انقر فوق الزر خمسة وسيظهر المؤشر. استخدم المؤشر لتحديد القاعدة التي يتم من خلالها قياس مسافة الطرف المستقيم.

متبوعا بطرف الخيط في الإطار حيث يظهر لأول مرة. بعد ذلك ، حدد طول العتبة الذي ستنحني فوقه الخيطية ، باستخدام 6 درجة مئوية. بعد ذلك ، حدد عدد المقاطع المستخدمة لتقريب شكل الصف في المربع 6A.

حدد عرض المسح الضوئي، الذي يعمل كماسح ضوئي أفقي، لوضع العقد في 6B. حدد نصف قطر المسح الضوئي في المربع 6D، واستخدم قيمة أكبر بنسبة 50٪ تقريبا من إزاحة طرف الإطارات بين الإطارات المرصودة. ثم حدد زاوية الانحناء في المربع 6E.

حدد تتبع محفوظات المربع في نافذة واجهة المستخدم الرسومية الثانية ، لحفظ بروتوكول التتبع بالكامل للرجوع إليه في المستقبل ثم انقر فوق زر التتبع والتحليل لبدء التتبع. للتحليل الزمني المكاني ، حدد المربع الذي يمثله 8B ، متبوعا بقناة البروتين ذات الأهمية. انقر فوق 8A ، لبدء تتبع البروتين على طول الأرجل الخيطية ، باستخدام التتبع الذي تم إنشاؤه مسبقا.

لتحليل البروتين النسبي ، حدد المربع 9B أو 9C وانقر على الزر 9A للحصول على مخطط النسبة الزمنية المكانية. لإجراء تحليل الطرف العرضي، حدد الخانة 8F وحدد طول الطرف وطول العتبة من القاعدة، باستخدام 8G و8H. انقر فوق الزر الانضغاطي ، لحفظ البيانات في ملف Excel باسم dynamics.xlsx.

ثم انقر فوق تحليل شدة البروتين لتوليد أثر شدة البروتين في الطرف الخيطي وحفظه لتحليل القياس النسبي. انقر فوق النسبة المطلوبة ليتم تحليلها باستخدام 9D أو 9E. أخيرا ، انقر فوق زر المقارنة ، 9A لإنشاء بيانات النسبة.

يكشف تحليل خلايا COS المنقولة بعلامة للأكتين الخيطي باللون الأحمر ، ومرجع العصارة الخلوية باللون الأخضر عن نتوءات خيوطية الأقدام الغنية بالأكتين. تظهر السلسلة الزمنية أن النتوءات الخيطية الغنية بالأكتين تمتد وتتراجع بسرعة. باستخدام برنامج تحليل الصور ، تم تتبع الخيط الفردي.

يتتبع برنامج تحليل الصور بشكل موثوق الامتداد الخافي ، بالإضافة إلى معدلات النمو والتراجع للخيطية الفردية ، تصور الصور الكيميائية أيضا تركيز الأكتين الطبيعي إلى مرجع العصارة الخلوية. إذا تم استخدامها بشكل صحيح ، تسمح هذه التقنية بالتحليل الكمي لديناميكيات النتوء وتركيز البروتين الذي تم حله مكانيا على طول الخيط. عند محاولة الإجراء ، من المهم تذكر سرعة الاستحواذ والحفاظ على نسبة الإشارة إلى الضوضاء أكبر من أربعة ، مع عدم تشبع الصور الفردية.