تتبع البروتينات المفردة في طبقات الدهون الثنائية باستخدام المجهر الفلوري

تعمل البروتينات في فضاء حالات معقد والكثير منه مخفي. نستخدم التصوير بجزيء واحد لكشف هذه الحالات. عند تتبع بروتينات الغشاء الواحد في طبقة ثنائية الدهون، تكون التحديات الرئيسية هي تحضير العينات، والتبييض الضوئي، والدقة الزمنية.

للبدء، أزل محاليل ساق الدهون من الفريزر ودعها تصل إلى درجة حرارة الغرفة. أخرج قارورة نظيفة بسعة 10 ملليلتر من الفرن واتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 900 ميكرولتر من الكلوروفورم الطيفي، و100 ميكرولتر من الميثانول الطيفي إلى القوارير الدائرية المبردة.

ثم أضف الكميات المناسبة من كل دهون إلى القارورة وقم بخلطها جيدا. الآن ضع موصل تقطير فراغي فوق قارورة القارورة المستديرة في الأسفل وثبتها على خط تجفيف النيتروجين. ثم شغل غاز النيتروجين وضبط الضغط حتى يشعر به التدفق بالكاد على ظهر اليد.

قم بعمل ملليتر واحد من المحلول المؤقت لكل خمسة ميكرومول من إجمالي الدهون في قارورة القاع المستدير. ضع سدادة زجاجية على القارورة وأغلقها بطبقة من البارافين. ضع القارورة والمشبك على حامل حلقي واغمره قاعه في حمام صوتي بدرجة 60 درجة مئوية.

تأكد من أن المحلول يصبح معتما وأنه لا تبقى أي دهون ملتصقة بجدار القارورة الداخلي. بعد فترة حضانة لمدة ساعة، شغل جهاز الصوت واضبط السعة على أعلى مستوى. حرك القارورة داخل الحوض لتحديد المكان الذي يوجد فيه أقوى تحريك حيث يتحرك المحلول ويرش بوضوح داخل القارورة.

استخدم المحلول لمدة 30 دقيقة. ملاحظة الانتقال من التعتيم إلى الشفاف وقليل من الشفافية. أزل محلول الدهون من القارورة وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

قم بطرد المركزي في الأنبوب على حرارة 100,000 جرام لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة المادة الفائقة ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد. ضع غطاء الكوارتز بقطر 25 ملم داخل كأس وأضف كميات متساوية من الماء النانوي النقي، و30٪ بيروكسيد الهيدروجين، وحمض النيتريك المركز.

سخن الغطاء في المحلول المعد لمدة 30 دقيقة حتى يبدأ الفقاعات. تحقق من المحلول كل 10 دقائق وقم بتدوير المحلول بلطف لمنع انزلاق الغطاء من الالتصاق ببعضها. لاحظ انزلاق الغطاء وهو ينفصل وينفصل أثناء الدوران.

بعد الفصل، قلل تدريجيا من سرعة الدوران للحفاظ على الفصل والسماح للمحلول الفقاعي بتغطية الغطاء بشكل متساو. ثم اشطف غطاء الغطاء جيدا بماء منقي مع التدوير بلطف لإزالة كل بقايا المواد الكيميائية. بدلا من ذلك، نظف شرائح غطاء الكوارتز باستخدام n-هيكسان متبوعا بالميثانول، مع مسح كل مذيب باستخدام نسيج العدسة.

ضع شرائح الغطاء داخل منظف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية بحيث يكون السطح المراد معالجته مواجها للمصباح. دع الأكسجين يتدفق إلى الحجرة بقوة خمسة أرطال لكل بوصة مربعة لمدة خمس دقائق. ثم أوقف تدفق الأكسجين.

الآن شغل أضواء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، ثم اترك انزلاق الغطاء ليستريح لمدة لا تقل عن 10 دقائق حتى يتلاشى الأوزون. ضع غطاء نظيف حديثا في حامل عينات بقطر 25 ملم. باستخدام أنبوب SM بقطر ربع بوصة واحد عدسة واحدة، قم بقص حشوة فيلم ذات طبقتين بقطر ثمانية مليمترات وضعها في وسط حامل العينة.

ضع قطرة بحجم 50 ميكرولتر من الحويصلات الأحادية الصفيحية الصغيرة على مركز الحشوة بحجم ثمانية ملم. بعد إغلاق الحجرة، حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة. بعد الحضانة، استخدم ماصة لشطف المحلول.

أضف 50 ميكرولتر من المخزن الطازج إلى الطبقة الثنائية وكرر هذه العملية 10 مرات إجمالا. بعد الشطف النهائي، أزل المخزن من حامل العينة. أضف كمية 50 ميكرولتر من البروتين المطلوب في المنظف، مع التأكد من أن التركيز عند أو أقل من تركيز الميسيلا الحرج.

حضن العينة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل للسماح بدمج البروتين، ثم شطف العينة بمحلول مؤقت لإزالة أي بروتين أو منظف غير مدمج. اضبط سرعة إزاحة البكسل الرأسية إلى حوالي 600 نانوثانية وزيادة جهد الساعة الرأسية باستخدام وضع رفع السرعة. ثم قم بضبط قراءة البكسل الأفقية على أقصى سرعة.

اضبط كسب المضخم المسبق إلى اثنين. اضبط خرج المضخم لضرب الإلكترونات واضبط كسب مضاعف الإلكترون إلى أعلى مستوى له. ثم اضبط وقت التعريض إلى 25 مليثانية.

تأكد من أن معدل الإطارات الفعلي يتجاوز وقت التعريض قليلا. الآن اضبط طاقة الليزر حتى تبرز الإشارة بوضوح من بين الضوضاء الخلفية. اجمع بيانات تصوير كافية لإنتاج ما لا يقل عن 1000 مسار لكل عينة.

لتحليل التتبع، قم بقص جميع مجموعات البيانات إلى حجم ثابت وإجراء تصحيح خلفية باستخدام Image J.In Fiji، ثم سحب وإفلات الفيلم، أو تكديس ملف TIFF الذي يحتاج إلى تحليله في الواجهة. لإدخال تفاصيل معايرة البكسل، اذهب إلى تبويب التحليل، اختر تعيين المقياس، وطبق البكسل على معايرة المسافات الخاصة بالجهاز. ثم احفظ نسخة من مجموعة البيانات للحفاظ على الأصل وتتبع أي تغييرات أجريت.

اطرح الخلفية من منطقة محددة محل اهتمام وطبقها على النسخة المحفوظة من البيانات الأصلية. اذهب إلى تبويب العملية واختر طرح الخلفية. في تبويب الإضافات، اختر التتبع، ثم خيار trackmate لتفعيل نافذة حوار trackmate لتحليل التتبع.

تم حساب درجة الوسم لأربعة رباعيات AQP لتكون 4.12 باستخدام مطيافية مرئية بالأشعة فوق البنفسجية، وأشار تحليل توزيع بواسون إلى أن 98٪ من الرباعيات تحمل على الأقل جزيء صبغة فلورية واحد. يظهر المدرج توزيعا واسعا لأحجام الخطوات المتوافق مع انتشار مصفوفات الجسيمات المتعامدة ذات الأحجام المختلفة، وكان متوسط معامل الانتشار المحسوب 0.0143 ميكرومتر مربع في الثانية. في هذا الفيديو، حددنا الحالات الرئيسية المهمة لتنظيم الأكوابورين الرابع والقوى الديناميكية الحرارية المرتبطة به.

يلغي هذا البروتوكول التخمين عند إنشاء أغشية حيوية ببروتين عبر الغشاء المنقي مناسبة لتتبع الجزيء الواحد بالفاصل الزمني. تمكن آلات البروتين التي تعمل عند نقاط التحول من تتبع البروتين الواحد بتقنية التداخل الفوري الملاحظة المباشرة للمسارات العشوائية والفروع والنهايات المسدودة.