دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير سياق لتحليل التعبير الجيني بطريقة خاصة بدورة الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السرطان المتعلقة بأحداث النسخ المعتمدة على دورة الخلية والتي تكمن وراء التحول الخبيث وكذلك العلاج المضاد للسرطان. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يؤسس بدقة أنماط التعبير الجيني المحددة لمرحلة دورة الخلية في كل من الحالات الثانية وبعد التعرض للعلاج الكيميائي.

تستخدم خلايا U2OS في هذه التجربة ، ويجب زرعها في أطباق 100 ملم في المساء حوالي الساعة السابعة مساء حتى يمكن تنفيذ الخطوات اللاحقة خلال ساعات العمل. دع الخلايا تلتصق عن طريق احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، افحص الخلايا للتأكد من أنها عند التقاء 50٪. بالنسبة لكتلة الثايميدين ، أضف 100 ميكرولتر من مخزون الثايميدين الطازج 200 ملليمولار إلى كل طبق ثقافة 100 ملم. احتضان الخلايا بالثيميدين عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة.

في اليوم التالي ، في حوالي الساعة الثالثة مساء ، قم بإطلاق الخلايا من كتلة الثايميدين عن طريق إزالة وسط النمو المحتوي على الثايميدين. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1X PBS الدافئ مسبقا.

ثم أضف 10 مل من الوسط الكامل إلى كل طبق 100 ملم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. لإيقاف الخلايا الانقسامية ، أضف نوكودازول إلى التركيز النهائي البالغ 50 نانوغرام لكل مليلتر.

احتضان الخلايا مع nocodazole لمدة لا تزيد عن 10 إلى 11 ساعة. في صباح اليوم التالي ، بين الساعة السادسة والسابعة صباحا ، افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر للتأكد من أنها محظورة بالفعل في G2-M ، مما يشار إليه بمظهرها المستدير.

افصل الخلايا الانقسامية عن طريق هز كل صفيحة ، وسحب النوكودازول الذي يحتوي على وسط نمو برفق مع خلايا منفصلة من كل صفيحة 100 ملم. امزج الخلايا الانقسامية من جميع الأطباق في أنبوب معقم سعة 50 ملليتر. جهاز طرد مركزي 300 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

اغسل الخلايا مرتين عن طريق إضافة 1X PBS بارد ، متبوعا بالطرد المركزي. بعد إزالة PBS من الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا الانقسامية في وسط مزرعة كامل. وفر ملليلترين لاستخراج الحمض النووي الريبي ، ومليلترين لتحليل FACS للنقطة الزمنية للساعة الصفرية.

أعد صفيحة الخلايا الانقسامية المتبقية للنقاط الزمنية اللاحقة في ستة ألواح آبار. لبدء هذا الإجراء ، قم بالبذور 0.25 في 10 إلى خلايا U2OS السادسة لكل بئر في ستة ألواح بئر. على غطاء كل ستة ألواح آبار اكتب الحالة التجريبية لكل بئر.

على سبيل المثال ، غير المعالجة أو المعالجة بتركيزات مختلفة من الدواء والنقاط الزمنية. دع الخلايا تلتصق عن طريق احتضان ألواح البئر الستة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، افحص الخلايا للتأكد من أنها في التقاء بنسبة 50٪.

قم بإزالة الوسط الكامل من الآبار ، وأضف ملليلترين من وسط DMEM-Glutamine المسخن مسبقا وخالي من FBS لكل بئر. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية. لإيقاف الخلايا بالهيدروكسي يوريا ، قم بإزالة الوسط من الآبار ، واستبدلها بأربعة هيدروكسي يوريا ميكرومولار محضرة حديثا تحتوي على وسط كامل.

احتضان الخلايا في هيدروكسي يوريا التي تحتوي على وسط لمدة 24 ساعة. قبل تحرير الخلايا من الاعتقال بوساطة هيدروكسي يوريا ، تحقق من الخلايا للتأكد من القبض عليها. قم بإزالة الهيدروكسي يوريا المحتوية على وسط من الآبار ، واشطف الآبار مرتين باستخدام 1X PBS الدافئ مسبقا.

بعد إزالة PBS من الغسيل الثاني ، أضف ملليلترين من الوسط الكامل لكل بئر. احتفظ بالأطباق في الحاضنة حتى جمع العينات. يتم جمع العينات من كلا بروتوكولي التزامن بنفس الطريقة لتحليل FACS واستخراج الحمض النووي الريبي.

لتحليل FACS ، اشطف كل بئر بملليلترين من 1X PBS الدافئ مسبقا ، ثم أضف 0.3 مل من محلول Trypsin-EDTA الدافئ مسبقا لفصل الخلايا. بعد خمس دقائق ، قم بإلغاء تنشيط Trypsin-EDTA عن طريق إضافة مليلتر واحد من الوسط الكامل. اجمع كل عينة في أنبوب منفصل سعة 15 مل.

خلايا الطرد المركزي عند 300 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ، واغسلها باستخدام 1X PBS وقم بتدويرها مرة أخرى. قم بإزالة PBS وحفظ الحبيبات الخلوية.

من أجل إصلاح الخلايا ، أعد تعليق كل حبيبات خلوية في مليلتر واحد من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪ عن طريق الدوامة برفق. ضع الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة تقريبا قبل تلطيخ يوديد البروبيديوم وتحليل FACS. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، قم بإزالة الوسط واشطف كل بئر بملليلترين من 1X PBS الدافئ مسبقا.

خذ اللوحة إلى خزانة أمان ، وأضف ملليلترا واحدا من كاشف عزل الحمض النووي الريبي المناسب لكل بئر. Pipet لأعلى ولأسفل إلى ماصة الخلايا وتحللها ثم نقل كل خلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ابدأ إجراء استخراج الحمض النووي الريبي عن طريق استرداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من الفريزر مع عينات في كاشف عزل الحمض النووي الريبي ، وإذابتها في درجة حرارة الغرفة داخل خزانة أمان للمواد الكيميائية. أضف 400 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل عينة ورجه بقوة دون دوامة حتى تمتزج تماما. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

الطرد المركزي الأنابيب لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق أعلى مقاعد البدلاء. انقل الطور المائي لكل عينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليتر. أضف حجما واحدا من الإيثانول بنسبة 100٪ ببطء ، قطرة قطرة ، إلى المرحلة المائية أثناء الخلط.

لا تستخدم أجهزة الطرد المركزي. انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من كل عينة بما في ذلك أي راسب قد يكون قد تشكل في عمود دوران في أنبوب تجميع سعة ملليلترين توفره مجموعة تحضير الحمض النووي الريبي المصغرة التجارية ، وأغلق الغطاء. جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية.

تجاهل التدفق. إذا بدأت من أكثر من 700 ميكرولتر لكل عينة ، فقم بنقل العينة المتبقية إلى عمود الدوران ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. بعد غسل الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، قم بمسح كل عينة عن طريق سحب 30 إلى 40 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز في عمود الدوران ، والطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

تحديد تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء العينات عن طريق قياسات الامتصاص. قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى استخدامها لتحليل التعبير الجيني. العلاج بواسطة بروتوكول Thymidine-Nocodazole يوقف خلايا U2OS في دخول المرحلة m ، ويوفر مجموعة خلايا تتقدم بشكل متزامن من خلال G1 وإلى المرحلة S كما هو موضح في تحليل قياس التدفق الخلوي.

العلاج بواسطة بروتوكول Hydroxyurea يعيق الخلايا عند حدود G1 / S. عند التحرير ، تنتقل الخلايا بشكل متزامن عبر مرحلتي S و G2. بروتوكول Thymidine-Nocodazole هو الأنسب لتحليل ملفات تعريف mRNA للجينات ذات الذروة التعبير خلال مرحلة G1.

كما هو موضح للتعبير E2F1. على النقيض من ذلك ، يعمل بروتوكول Hydroxyurea بشكل أفضل لتحليل الجينات ذات التعبير التفضيلي في S أو G2 ، كما هو موضح في تعبير E2F7. عادة ما تكون دورة الخلية مضطربة بالأدوية المضادة للورم ، كما هو موضح في توقف طور G2 الدائم المفروض على الميتومايسين C في الخلايا المتزامنة مع هيدروكسي يوريا.

يساعد sychronization الخلية على تمييز الجينات التي تستجيب للعامل المضاد للورم من تلك التي تتأثر فقط باضطرابات دورة الخلية التي يفرضها العامل ، على سبيل المثال ، من المحتمل أن يكون انخفاض مستويات E2F1 mRNA بعد علاج mitomycin C تأثيرا غير مباشر للدواء على ديناميكيات دورة الخلية. على النقيض من ذلك ، فإن ذروة تعبير p21-Cip1 mRNA بعد العلاج بالميتومايسين C هي نتيجة مباشرة لبرنامج النسخ الذي يبدله هذا الدواء. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل نسخي واسع للجينوم وكذلك البروتينات ، من أجل الكشف عن تغييرات التعبير الجيني العالمي التي تؤثر على مراحل معينة من دورة الخلية.

إما في الحالات الثانية أو في العلاجات المضادة للأورام. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للإجراءات المطلوبة لإجراء تحليل التعبير الجيني في مزارع الخلايا المتزامنة. لا تنس أن العمل مع كواشف عزل بروبيديوم يوديد أو الحمض النووي الريبي يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات وخزانة الأمان للمواد الكيميائية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.