دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير سياق لتحليل التعبير الجيني بطريقة محددة لدورة الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال السرطان تتعلق بأحداث النسخ المعتمدة على دورة الخلية والتي تكمن وراء التحول الخبيث وكذلك العلاج المضاد للسرطان. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يحدد بدقة أنماط التعبير الجيني المحددة لمرحلة دورة الخلية، وذلك في كل من الظروف الطبيعية وبعد التعرض للعلاج الكيميائي.

تُستخدم خلايا U2OS في هذه التجربة، ويجب استزراعها في أطباق قطرها 100 مليمتر في المساء حوالي الساعة السابعة مساءً بحيث يمكن تنفيذ الخطوات اللاحقة خلال ساعات العمل. اترك الخلايا تلتصق عن طريق تحضين الأطباق عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO2 لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي، افحص الخلايا للتأكد من وصولها إلى 50% من درجة التلاقي (confluency). وبالنسبة لحصار الثيميدين (Thymidine block)، أضف 100 µL من محلول الثيميدين المركز بتركيز 200 mM المحضر حديثاً إلى كل طبق زراعة بمقاس 100 mm. حضن الخلايا مع الثيميدين عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO2 لمدة 20 ساعة.

في اليوم التالي، وفي حوالي الساعة الثالثة مساءً، يتم تحرير الخلايا من حصار الثيميدين (Thymidine block) عن طريق إزالة وسط النمو المحتوي على الثيميدين. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1X PBS مُدفأ مسبقاً.

ثم أضف 10 milliliters من الوسط الكامل إلى كل طبق قطر 100 millimeter. حضن الخلايا عند 37 °C لمدة خمس ساعات. ولإيقاف الخلايا في الطور الميتوزي، أضف nocodazole ليصل إلى تركيز نهائي قدره 50 ng/mL.

قم بتحضين الخلايا مع nocodazole لمدة لا تزيد عن 10 إلى 11 ساعة. وفي صباح اليوم التالي، بين الساعة السادسة والسابعة صباحاً، افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها محتجزة بالفعل في طور G2-M، وهو ما يستدل عليه من مظهرها المستدير.

قم بفصل الخلايا في مرحلة الانقسام الفتيلي عن طريق رج كل طبق، وسحب الوسط الغذائي المحتوي على nocodazole والخلايا المنفصلة بلطف باستخدام الماصة من كل طبق قطره 100 مليمتر. اجمع الخلايا المنقسمة من جميع الأطباق في أنبوب معقم سعة 50 ملليلتر. قم بالطرد المركزي بسرعة 300 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.

اغسل الخلايا مرتين عن طريق إضافة 1X PBS بارد، يليه عملية الطرد المركزي. بعد إزالة PBS من الغسلة الثانية، أعد تعليق الخلايا في مرحلة الانقسام الفتيتي في وسط زراعة كامل. احتفظ بملليلترين لاستخلاص RNA، وملليلترين لتحليل FACS لنقطة الزمن صفر ساعة.

أعد زراعة الخلايا الميتوزية المتبقية لنقاط زمنية لاحقة في أطباق ذات ستة آبار. لبدء هذا الإجراء، ازرع 0.25 × 10⁶ من خلايا U2OS لكل بئر في أطباق ذات ستة آبار. اكتب على غطاء كل طبق ستة آبار الحالة التجريبية لكل بئر.

على سبيل المثال، خلايا غير معالجة أو معالجة بتراكيز مختلفة من الدواء وفترات زمنية متفاوتة. اترك الخلايا تلتصق عن طريق تحضين أطباق الستة آبار طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، افحص الخلايا للتأكد من وصولها إلى درجة تلاقي 50%.

قم بإزالة الوسط الغذائي الكامل من الآبار، وأضف اثنين مللي لتر من وسط DMEM-Glutamine الخالي من FBS والمسخن مسبقاً لكل بئر. قم بتحضين الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية. لإيقاف نمو الخلايا باستخدام hydroxyurea، قم بإزالة الوسط الغذائي من الآبار واستبداله بوسط غذائي كامل يحتوي على hydroxyurea بتركيز أربعة ميكرومولار محضر حديثاً.

قم بحضن الخلايا في وسط يحتوي على hydroxyurea لمدة 24 ساعة. وقبل تحرير الخلايا من التوقف الناتج عن hydroxyurea، افحص الخلايا للتأكد من توقفها. قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على hydroxyurea من الآبار، واشطف الآبار مرتين باستخدام 1X PBS مُدفأ مسبقاً.

بعد إزالة محلول PBS من الغسلة الثانية، أضف ملليلترين من الوسط الغذائي الكامل لكل بئر. احتفظ بالأطباق في الحاضنة حتى موعد جمع العينات. تُجمع العينات من كلا بروتوكولي المزامنة بنفس الطريقة لإجراء تحليل FACS واستخلاص RNA.

لإجراء تحليل FACS، اشطف كل بئر بملليلترين من محلول 1X PBS المسخن مسبقاً، ثم أضف 0.3 ملليلتر من محلول Trypsin-EDTA المسخن مسبقاً لفصل الخلايا. بعد خمس دقائق، قم بتعطيل Trypsin-EDTA بإضافة ملليلتر واحد من الوسط الغذائي الكامل. اجمع كل عينة في أنبوب منفصل سعة 15 ملليلتر.

قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل العلوي، واغسل الخلايا باستخدام 1X PBS ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى. أزل PBS واحتفظ بالراسب الخلوي.

لتثبيت الخلايا، أعد تعليق كل كتلة خلوية في 1 mL من الإيثانول 70% المبرد عن طريق الرج الخفيف باستخدام جهاز الفورتيكس. ضع الخلايا على الثلج لمدة 15 دقيقة تقريبًا قبل صبغها بـ propidium iodide وإجراء تحليل FACS. أما لاستخلاص RNA، قم بإزالة الوسط واغسل كل بئر بـ 2 mL من 1X PBS المعد مسبقًا.

انقل الطبق إلى كابينة السلامة، وأضف 1 mL من كاشف عزل RNA المناسب لكل بئر. قم بسحب السائل وإطلاقه بالمصّة لخلط وتحليل الخلايا، ثم انقل كل ناتج تحليل خلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ابدأ إجراء استخلاص الـ RNA عن طريق إخراج أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على العينات في كاشف عزل الـ RNA من المجمد، وإذابتها في درجة حرارة الغرفة داخل خزانة سلامة كيميائية. أضف 400 µL من الكلوروفورم إلى كل عينة ورجها بقوة دون استخدام جهاز الـ vortex حتى تتمازج تماماً. قم بتحضين العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق مكتبي. انقل الطور المائي من كل عينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 milliter. أضف حجماً واحداً من 100%ethanol ببطء، قطرة تلو الأخرى، إلى الطور المائي مع المزج.

لا تقم بالطرد المركزي. انقُل ما يصل إلى 700 µL من كل عينة، بما في ذلك أي راسب قد يكون قد تشكل، إلى عمود دوران في أنبوب تجميع سعة 2 mL متوفر في طقم استخلاص RNA mini-prep تجاري، ثم أغلق الغطاء. قم بالطرد المركزي لمدة 15 ثانية.

تخلص من السائل المتدفق. في حال البدء بكمية تزيد عن 700 µL لكل عينة، انقل ما تبقى من العينة إلى عمود الطرد المركزي، وقم بالدوران مرة أخرى. بعد غسل الـ RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، قم باستخلاص كل عينة عن طريق إضافة 30 إلى 40 µL من الماء الخالي من النيوكلياز في عمود الطرد المركزي، ثم قم بالدوران في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

تحديد تركيز الحمض النووي الريبوزي (RNA) ودرجة نقاوة العينات عن طريق قياسات الامتصاصية. تخزين عينات الـ RNA في درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يحين استخدامها في تحليل التعبير الجيني. تؤدي المعالجة وفق بروتوكول Thymidine-Nocodazole إلى إيقاف خلايا U2OS عند بداية طور m، مما يوفر مجتمعاً خلوياً يتقدم بشكل متزامن عبر طور G1 وصولاً إلى طور S كما يظهر في تحليل قياس التدفق الخلوي.

تؤدي المعالجة وفق بروتوكول الهيدروكسي يوريا إلى إيقاف الخلايا عند الحد الفاصل بين مرحلتي G1 وS. وعند رفع التثبيط، تنتقل الخلايا بشكل متزامن عبر مرحلتي S وG2. أما بروتوكول الثيميدين-نوكودازول فهو الأكثر ملاءمة لتحليل أنماط mRNA للجينات التي تصل ذروة تعبيرها خلال مرحلة G1.

كما هو موضح بالنسبة للتعبير عن E2F1. وفي المقابل، فإن بروتوكول الهيدروكسي يوريا يعمل بشكل أفضل لتحليل الجينات ذات التعبير التفضيلي في مرحلتي S أو G2، كما هو موضح بالنسبة للتعبير عن E2F7. عادةً ما يتم تعطيل الدورة الخلوية بواسطة الأدوية المضادة للأورام، وما يظهر هنا هو توقف دائم في مرحلة G2 فرضه عقار mitomycin C في الخلايا المتزامنة باستخدام الهيدروكسي يوريا.

يساعد تزامن الخلايا في التمييز بين الجينات التي تستجيب للعامل المضاد للأورام وتلك التي تتأثر فقط بالاضطرابات في دورة الخلية التي يسببها هذا العامل؛ فعلى سبيل المثال، يُرجح أن يكون انخفاض مستويات mRNA لـ E2F1 بعد المعالجة بـ mitomycin C تأثيراً غير مباشر للدواء على ديناميكيات دورة الخلية. وفي المقابل، فإن ذروة تعبير mRNA لـ p21-Cip1 بعد المعالجة بـ mitomycin C هي نتيجة مباشرة لبرنامج نسخ حفزه هذا الدواء. وعقب هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل ترانسكريبتومي وبروتومي على مستوى الجينوم بأكمله، وذلك للكشف عن تغيرات التعبير الجيني العالمية التي تؤثر على مراحل محددة من دورة الخلية.

سواء في ظل ظروف عددية اثنين أو عند الخضوع لعلاجات مضادة للأورام. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد للإجراءات المطلوبة لإجراء تحليل التعبير الجيني في المزارع الخلوية المتزامنة. لا تنسَ أن العمل باستخدام يوديد البروبيديوم أو كواشف عزل RNA يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات واستخدام خزانة السلامة الكيميائية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.