الجمع بين الخلية الانقسامية المزامنة وعالية الدقة [كنفوكل] الفحص المجهري لدراسة دور البروتينات المتعددة الوظائف دورة الخلية أثناء الانقسام

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تزامن الثايميدين المزدوج والفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة لدراسة الأدوار الانقسامية للبروتينات متعددة الوظائف التي قد تمتلك وظائف الطور البيني الحرجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، حول كيفية تحديد الوظائف الطبيعية للبروتينات المشاركة في دورة الخلية والانقسام. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الخلايا يمكن أن تحافظ على سلوكها الفسيولوجي الطبيعي وأن هذه الطريقة سهلة التنفيذ أيضا.

سيوضح هذا الإجراء الدكتور محمد أمين، وهو طبيب ما بعد الدكتوراه من مختبري، وهو خبير في استخدام هذه الطريقة. لتصوير الخلايا الثابتة لتطور الخلايا الانقسامية ، ابدأ بزرع ما يقرب من مرتين 10 إلى خلايا HeLa الخامسة في كل بئر من صفيحة من ستة آبار ، تحتوي على 70٪ من الإيثانول وغطاء معقم بالأشعة فوق البنفسجية ومليلترين من وسط DMEM. بعد 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا ، قم بسد الخلايا بملليلترين من الثايميدين المخفف حديثا والوسط الطازج لكل بئر ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 18 ساعة أخرى.

في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرتين بملليلترين من PBS ، ومرة واحدة بوسط 37 درجة مئوية طازج. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة تسع ساعات لتحرير الخلايا من الكتلة ، متبوعا بإضافة ملليلترين آخرين من الوسط المكمل بالثيميدين لكل بئر. بعد حضانة الحجب الثانية ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام ملليلترين من PBS ، ومرة واحدة بملليلترين من الوسط الطازج 37 درجة مئوية ، وأضف 100 نانومولار من siRNA المحضرة حديثا إلى الآبار المناسبة.

بعد تسع إلى 10 ساعات ، قم بشفط المادة الطافية وقم بتثبيت الخلايا على زلات الغطاء بنسبة أربعة بالمائة من بارافورمالدهايد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل باستخدام PBS ، قم باختراق الخلايا الثابتة بمنظف 0.5٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسلتين لمدة خمس دقائق في PBS. قم بسد الخلايا بواحد بالمائة من BSA في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتسمية الخلايا ب 50 ميكرولترا من الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في PBS ، وقم بتسميتها ب 50 ميكرولترا من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة ذات الأهمية. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الخلايا مرتين في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة ، وقم بتسمية الخلايا ب DAPI لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اتبع تلطيخ DAPI بغسلتين لمدة خمس دقائق في PBS واستخدم وسيط التثبيت المناسب لتركيب زلات الغطاء على شرائح مجهر شفافة فردية. بعد ذلك ، باستخدام خطة الفتحة العددية 60 أو 100 × 1.4 أهداف الغمر في الزيت DIC المركبة على مجهر متحد البؤر مقلوب عالي الدقة مزود بكاميرا مناسبة ، احصل على صور للبروتينات الملطخة بالمناعة في مداخن Z بسماكة 0.2 ميكرومتر. لتصوير الخلايا الحية لتطور الخلايا الانقسامية ، قم بالبذور ما يقرب من 0.5 إلى واحد في 10 إلى خلايا HeLa الخامسة التي تعبر بثبات عن mCherry H2B و GFP alpha-tubulin في أطباق ذات قاع زجاجي سعة 35 مليلتر تحتوي على 1.5 مل من وسط DMEM.

قم بزراعة الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، يقوم الثايميدين بمنع الخلايا مرتين كما هو موضح للتو ، وهذه المرة غسل الخلايا مرتين باستخدام ملليلترين من PBS ومرة واحدة بمليلتر واحد من وسط DMEM الدافئ مسبقا في نهاية كل كتلة ثيميدين ومعالجة الخلايا باستخدام siRNA بعد الكتلة الأولى أثناء غسل الثايميدين الأول. قم بزراعة الخلايا في وسط ليبوفيتز الطازج الدافئ مسبقا ، مع استكمال 10٪ FBS و 20 ملليمولار HEPES لمدة ثماني ساعات لتحرير الخلايا من الكتلة الثانية.

ثم ضع اللوحة الأولى في الغرفة التي يتم التحكم في درجة حرارتها في مجهر متحد البؤر عالي الدقة ، واستخدم التصوير الموضوعي والمجال الساطع 60 X لتركيز الخلايا. عندما تكون الخلايا مرئية ، اضبط موضع اللوحة يدويا على المنطقة التي تختارها واستخدم برنامج الحصول على الصور لضبط طاقة الليزر والتعرض ، ومعلمات الحصول على الصور ، وفترة مدة التجربة. حدد مرشحات GFP و mCherry المناسبة واحصل على صور الضوء النبضي المنقول والفلورة كل 10 دقائق لمدة تصل إلى 16 ساعة ، للحصول على صور بفاصل زمني لعملية الانقسام.

بعد تسع ساعات من إطلاقها من كتلة الثايميدين المزدوجة ، احصل على الصور عند 12 طائرة z مفصولة بميكرومتر واحد. ثم قم بتحليل الصور عن طريق تتبع الخلايا الانقسامية الفردية واستخدام برنامج المصدر المناسب لتجميع فيلم مقابل. على الرغم من أن معظم خلايا التحكم و Cdt1 siRNA في مرحلة الطور بعد تسع ساعات من إطلاقها من كتلة الثايميدين المزدوجة ، إلا أن التثبيت في 10 ساعات يكشف أن معظم الخلايا المعالجة ب Cdt1 siRNA لا تزال يتم القبض عليها في الطور الأولي المتأخر ، بينما تدخل خلايا التحكم في الطور الطوري وتفصل كروموسوماتها كما هو متوقع.

العلاج البارد بعد تسع ساعات من إطلاقه من كتلة الثايميدين المزدوجة الاحتفاظ بالأنابيب الدقيقة الحركية المستقرة والتي تكون أقل قوة نسبيا في الخلايا المستنفدة Cdt1 مقارنة بتلك الموجودة داخل الخلايا المستنفدة من السيطرة. لا يتم إزعاج ترخيص أصل تكرار الحمض النووي في الخلايا المستنفدة من Cdt1 أو التحكم خلال مرحلة G2-M ، حيث لم يتم العثور على هذه الخلايا للحث على تراكم جاما الفوسفورية H2AX ، وهي علامة لتلف الحمض النووي ، خلال مرحلة G2 اللاحقة. ومع ذلك ، فإن تعداء Cdt1 siRNA للثقافات غير المتزامنة يحفز تراكم البؤر الإيجابية لفوسفو جاما H2AX ربما بسبب تلف الحمض النووي الناجم عن ترخيص تكرار الحمض النووي غير السليم.

بعد انهيار الغلاف النووي ، تدخل الخلايا الطبيعية في الانقسام وتخضع لبداية الطور للخروج من الانقسام في غضون 30 إلى 60 دقيقة. ومع ذلك ، فإن الضربة القاضية بوساطة RNAi ل Hec1 ، وهو بروتين حركي رئيسي مطلوب لتكوين الأنابيب الدقيقة الحركية القوية ، يؤخر التقدم الانقسامي الطبيعي إلى بداية الطور أو الخروج من الانقسام حتى بعد عدة ساعات من تأخير الانقسام. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر إذابة الثايميدين تماما بعد إذابته من الفريزر. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل النشاف الغربي للإجابة على أسئلة إضافية مثل ، ما هي أنماط التعبير عن البروتينات ذات الأهمية أثناء الانقسام الفتيلي مقارنة بالطور البيني؟ بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف التكوين الحيوي للسرطان في نماذج زراعة الخلايا البشرية ، واستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة لتحديد الوظائف المتعلقة بدورة الخلية للبروتينات ذات الأهمية.

لا تنس أن العمل مع الكواشف مثل بارافورمالدهايد و DAPI يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر يجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.