توليف الكيماوي الانزيمية من N-جليكانس للتنمية الصفيف وأضداد الفيروس التنميط

الهدف العام من هذه المنهجية هو تطوير نهج كيميائي-إنزيمي معياري لتخليق الغليكانات من النوع N (N-glycans)، وذلك عن طريق بناء مصفوفة دقيقة جديدة من الغليكانات على شريحة زجاجية مطلية بأكسيد الألومنيوم للكشف عن ارتباط الغليكانات غير المتجانسة بالأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV). يمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم بيولوجيا الغليكانات لتحديد الغليكانات النوعية للفيروسات الخلوية من أجل المزيد من التطوير. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في القدرة على الكشف عن الارتباط الضعيف وتحديد خليط من السكريات التي ترتبط ببروتين معين، مثل الأجسام المضادة المستخلصة من مريض مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV).

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل تشخيص إصابات الإنفلونزا لأن محطّمات حمض السياليك يتم التعبير عنها في الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية البشرية، وتكون هذه القضايا شائعة أثناء ظهور الأعراض. وبناءً على ذلك، ستكون المصفوفة السكرية (glycoarray) أداة مثالية لتحديد خصوصية السلالات البرية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول خصوصيات الغليكان للأجسام المضادة لفيروس HIV، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل تشخيص أنواع مختلفة من السرطانات بناءً على نمط ارتباط الأجسام المضادة في المصل البشري تجاه مستضدات مصل بشرية محددة مطبوعة على السطح.

لبدء هذا الإجراء، أضف 2-5 micromoles من الغليكان الذي تم تحضيره مسبقاً إلى دورق مستدير القاع سعة خمسة milliliters. أضف قضيب تحريك مغناطيسي إلى الدورق وأغلقه بسدادة مطاطية. أضف 400 microliters من DMF المجفف حديثاً و 10-25 micromoles من رابط حمض الفوسفونيك إلى الدورق.

بعد ذلك، قم بتقليب خليط التفاعل بسرعة 800 rpm لمدة خمس ساعات. وبمجرد اكتمال التفاعل، قم بتبخير المذيب باستخدام مبخر دوراني عند ضغط فراغ يتراوح بين 5 إلى 10 millibar ودرجة حرارة 40 °C. عقب ذلك، قم بإذابة خليط التفاعل المجفف في 0.5 milliliter من الماء ثم قم بتحميله فوق طبقة هلام البولي أكريلاميد.

قم بشطف النواتج باستخدام الماء وجمع أجزاء تتراوح سعتها بين 1 إلى 2 مللتر. وللتحقق من الأجزاء المجمعة بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)، ضع نقطة من كل جزء على لوح TLC ثم اغمس اللوح في محلول Cerium Ammonium Molybdate بتركيز 0.25 مولار. سخن اللوح المصبوغ باستخدام لوح تسخين لإظهار الناتج.

بعد دمج الكسور التي تحتوي على المنتج وتجميد المحلول باستخدام جهاز biofolize للحصول على المنتج المطلوب في شكل مسحوق أبيض. بعد ذلك، أذب المنتج المجفف في 2 mL من الماء وأضف هيدروكسيد Palladium. ثبّت بالوناً يحتوي على الهيدروجين في الدورق وقم بتحريك خليط التفاعل بسرعة 800 rpm لمدة 15 ساعة تحت جو من الهيدروجين.

بمجرد اكتمال التفاعل، قم بترشيح الخليط عبر طبقة من Celite واغسله بـ 2 mL من الميثانول و 2 mL من الماء المقطر منزوع الأيونات. بعد ذلك، قم بتبخير المذيب باستخدام المبخر الدوار عند ضغط تفريغ يبلغ 300 millibar ودرجة حرارة 40 °C. عقب ذلك، أذب الخليط الخام في حوالي 1 mL من الماء وقم بتحميله فوق طبقة من هلام البولي أكريلاميد.

قم باستخلاص المنتج باستخدام الماء واجمع كسوراً بحجم واحد إلى اثنين ملليلتر. بعد دمج الكسور التي تحتوي على المنتج وتجميد المحلول، قم بإجراء التجفيف بالتجميد للحصول على المنتج المطلوب في شكل مسحوق أبيض. وبمجرد جفاف المنتج، قم بتوصيفه بواسطة NMR ومطيافية الكتلة باستخدام Deuterium Oxide كمذيب.

لإجراء الأنودة السطحية، اضبط حاضنة ذات تحكم حراري على درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، انقل محلول حمض الأوكساليك المائي بتركيز 0.3 molar المحضر مسبقاً إلى دورق سعة 500 milliliter يحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي. ضع قضيباً من البلاتين بطول 10 centimeter في المحلول ليعمل كمهبط (cathode).

استمر في تحريك حمض الأكساليك بسرعة 300 rpm طوال عملية الأنودة. في برنامج lab tracer، انقر فوق زر الإعداد (setup) ثم انقر فوق خيار الوظيفة مسح الجهد (Sweep Voltage). اضبط جهد البداية والنهاية على 25.8 volts.

اضبط عدد النقاط على 100، والامتثال على واحد، وتأخير المسح على 1200 مللي ثانية. بعد ذلك، انقر موافق. قم بتثبيت شريحة زجاجية مطلية بالألومنيوم بحيث يكون وجهها مواجهاً للكاثود.

انقر على زر تشغيل الاختبار (run test) ولاحظ القياس الحالي. بعد عملية الأنودة السطحية، اغسل الشريحة الزجاجية جيداً بالماء المقطر مرتين ثم جففها بتيار من غاز النيتروجين. احفظ الشريحة الزجاجية في غرفة ذات رطوبة نسبية 30% حتى حين استخدامها.

لأغراض التصنيع، قم بتحضير 100 µL من محاليل جميع الغليكانات أحادية التكافؤ في الإيثانول غليكول بتركيز 10 mM. خفف محاليل الغليكان باستخدام محلول الطباعة المنظم لتحضير محاليل بتركيز 100 µM. أما بالنسبة لدراسة الربيطة غير المتجانسة، فأضف 5 µL من غليكان MAN-5 إلى 5 µL من كل محلول غليكان.

انقل الغليكانات المُحضّرة إلى لوحة ميكروية ذات 384 بئراً لخطوة طباعة المصفوفة الدقيقة. بعد إدخال اللوحة الميكروية في تقنية مصفوفة الطابعة، قم بطباعة المصفوفات الدقيقة بواسطة دبوس روبوتي عن طريق ترسيب 0.6 nanoliters من محاليل الغليكان على كل شريحة زجاجية مطلية بالألمنيوم. بعد ذلك، قم بتحضير 70 microliters من الجسم المضاد الأولي PG-9 ومحلول PTSB المنظم الذي يحتوي على 3%BSA.

بعد ذلك، يتم تحضير 120 µL من الجسم المضاد الثانوي الموسوم فلورياً Donkey and Anti-human Immunoglobulin G ومحلول PBST المنظم الذي يحتوي على 3% BSA في الظلام. اخلط PG9 مع الجسم المضاد الثانوي الموسوم فلورياً بنسبة 1:1. ثم يتم تحضين الأجسام المضادة المخلوطة مسبقاً لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الحضانة، ضع شريحة زجاجية مطلية بالألومنيوم في غرفة حضانة الشرائح، المقسمة إلى 16 بئرًا. انقل 100 microliters من الأجسام المضادة المخلوطة مسبقًا إلى مصفوفة الغليكان. بعد الحضانة عند درجة حرارة 4 °C لمدة 16 ساعة، قم بإزالة الأجسام المضادة المخلوطة مسبقًا من مصفوفة الغليكان باستخدام ماصة، ثم قم بإزالة غرفة حضانة الشرائح.

اغسل الشريحة الزجاجية في محلول PBST المنظم والماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، قم بتجفيف الشريحة الزجاجية باستخدام جهاز الطرد المركزي بسرعة 2000 ×g. ثم افتح برنامج تحليل صور المصفوفات الدقيقة.

أدخل الشريحة الزجاجية المجففة في ماسح المصفوفات بحيث تكون المعالم المصفوفة متجهة لأسفل. انقر على قائمة الإعدادات. اضبط دقة الصورة على 5 µm لكل بكسل.

اضبط الطول الموجي عند 635 نانومتر مع ضبط PMT على 450 والقدرة على 100%. انقر فوق زر المسح لبدء تصوير الشريحة. وأخيراً، انقر فوق أيقونة الملف لحفظ صورة المسح بصيغة TIF لتحليل الصور. في هذه الدراسة، تم تخليق مجموعة واسعة من N-Glycans باستخدام استراتيجية كيميائية إنزيمية نمطية.

لإثبات فعالية هذه الاستراتيجية، تم تخليق بنية متساوية القياس ثنائية الهوائيات باستخدام طرق كيميائية إنزيمية. أدت عملية الغلكتوزة الإنزيمية للسكر الثنائي 1، متبوعة بعملية الفوكوزة للسكر الثلاثي 2، إلى الحصول على السكر الرباعي 3 المطلوب. وبإجراء عمليات الساتلة وتعديلات الطرف المختزل لوحدتي البناء الثانية والثالثة، تم الحصول على الجزيئين 4 و5 المطلوبين.

أدى التحلل السكري الانتقائي الفراغي لثلاث مجموعات O-glycosylation في الوحدة الرابعة من ثلاثي السكاريد six إلى الحصول على سداسي السكاريد seven. وأدى إزالة الحماية والتفاعل قبل الوحدة الخامسة إلى إنتاج عشاري السكاريد nine. كما أتاح الكشف الشامل الحصول على الغليكان 10 الذي تم توصيفه بواسطة NMR ومطيافية الكتلة.

تم تعديل الغليكانات التي تحتوي على ذيل بنتيل أمين (Pentylamine) عند الطرف المختزل باستخدام روابط من حمض الفوسفونيك، ثم رُبطت بسطح زجاجي مطلي بالألومنيوم عبر كيمياء الفوسفينيد. تم فحص خصوصية الغليكان للأجسام المضادة ذات التحييد واسع النطاق لـ HIV-1 والموسومة بـ PG9 باستخدام مصفوفات غليكان متجانسة وغير متجانسة، وذلك لإثبات تفاعلها لأول مرة مع الغليكانات غير المتجانسة المتجاورة في حلقة V1/V2 على سطح HIV1 PG120. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 24 ساعة، بدءاً من تثبيت الغليكان وصولاً إلى تحليل بيتا، شريطة تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام شريحة زجاجية مغطاة بالألومنيوم المؤكسد حديثاً لـ Glycan 10. وبالنسبة لتنفيذ هذا الإجراء، تُستخدم شرائح الفنيين الطبيين. يمكن إجراء تحديد الثابت الجسمي من أجل قياس تفاعلات الارتباط بين الكربوهيدرات والبروتين محل الاهتمام.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق أمام الباحثين لفهم دور الكربوهيدرات في الأمراض المعدية في كينيا بشكل أفضل، والمساعدة في تطوير علاجات جديدة ضد هذه الأمراض. لا تنسَ أن العمل مع العوامل السامة قد يكون خطيرًا للغاية، ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء الملابس الواقية والنظارات والأقنعة عند إجراء التجارب.