كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع

تصف مقالة الفيديو هذه إجراء للحصول على ملامح الارتباط بالجليكوزيل ل 20 بروتينا سكري مختلفا في عينة مصل مريض سرطان الخلايا الكبدية باستخدام مصفوفة دقيقة للأجسام المضادة المحظورة كيميائيا ، تتم طباعة الأجسام المضادة المحددة مباشرة على شرائح المصفوفات الدقيقة ويتم حظر جليكانات الأجسام المضادة لمنع ارتباط الليكتين. عندما يتم تطبيق عينات مصل الدم للمريض ، يتم التقاط البروتينات السكرية من العينة بواسطة الأجسام المضادة. ثم تضاف بروتينات ربط الجليكان البيوتينيل للكشف عن الجليكان ويضاف ثنائي نيو ترافان مترافق لتسمية الليكتينات الحيوية.

ثم يتم مسح شريحة المصفوفة الدقيقة ضوئيا للكشف عن تحليل التألق للبيانات الناتجة يكشف عن ملفات تعريف الارتباط بالجليكوزيل لبروتينات العينة. هذه التقنية لها العديد من المزايا مقارنة بالطريقة الحالية مثل HPLC. تسمح هذه الطريقة بالكشف عن البروتينات السكرية الفردية في حالتها الأصلية.

من الأسرع والأسهل فحص تغيير الارتباط بالارتباط لبروتينات متعددة في وقت واحد. حسنا ، وجدنا أن المؤشرات الحيوية للمرض ، وخاصة السرطان وسرطان الكبد ، والتي نظرنا إليها بعناية فائقة ، غالبا ما تكون غليكوزيلات. والقدرة على اكتشاف أشكال جليكو معينة وجدناها تعزز بشكل كبير أداء المؤشرات الحيوية في حساسيتها وخصوصيتها.

لذلك يمكن أن يوفر هذا المقياس نظرة ثاقبة حول تغيرات الارتباط بالجليكوزيل على بروتينات مصل متعددة في سرطان الكبد. يمكن أيضا تطبيقه على دراسة علم الأمراض واكتشاف المؤشرات الحيوية في أنواع السرطان والأمراض الأخرى مثل سرطان البنكرياس والسكري ومرض الزهايمر. سيوضح الإجراء تشن لو ، فني من مختبري.

ابدأ هذا البروتوكول بإعداد المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة أولا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 0.8 ملليلتر على الجليد ، وتخفيف جميع الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها لطباعة المصفوفات الدقيقة بتركيز 0.5 ملليغرام لكل مليلتر في 40 مل على الأقل من PBS هنا ، سيتم استخدام 26 جسما مضادا مختلفا كعنصر تحكم إيجابي. قم أيضا بإعداد نفس الكمية البالغة 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من BSA البيوتينيل في PBS. استخدم ماصة لنقل 40 مل من كل جسم مضاد في لوحة مصدر البئر 384 على الجليد.

ثم في برنامج التحكم في المصفوفة الدقيقة ، حدد كل موقع للجسم المضاد. بعد ذلك ، قم بتحميل اللوحة على المصفوفة الدقيقة كمصدر. ثم قم بتحميل 20 شريحة مصفوفة دقيقة للمسار على المصفوفة الدقيقة كهدف.

اضبط المصفوفة الدقيقة لطباعة 48 مصفوفة سوبار متطابقة حيث يتم رصد 27 جسما مضادا وبروتينات تحكم في ثلاث نسخ في نمط تسعة في تسعة. ابدأ تشغيل المصفوفة الدقيقة لطباعة شرائح المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة. اجمع شرائح المصفوفات الدقيقة للأجسام المضادة وقم بتخزينها في شريط منزلق مع مجفف.

أغلق الكاسيت في كيس بلاستيكي لمنع تمسخ البروتين والرطوبة على الشرائح أثناء التخزين. قم بتخزين شرائح المصفوفات الدقيقة المختومة عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامها. الجانب الوحيد الأصعب والأكثر أهمية في هذا الإجراء هو خطوة الحجب الكيميائي.

لضمان النجاح ، من الأهمية بمكان طباعة كمية كافية من الأجسام المضادة على ضوء المصفوفة الدقيقة. قم دائما بإعداد الصوديوم الطازج IDE والخلايا المائية الحمضية الزراعية مباشرة قبل التجربة. وتأكد من تنفيذ عملية الأكسدة عند أربع درجات ، وتجنب الضوء.

أخرج شرائح المصفوفة الدقيقة من الثلاجة وقم بتوازينها مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة شريحة من صندوق التخزين. اغمر الشريحة لفترة وجيزة في حوض غسيل يحتوي على PBS مع 0.1٪ tween 20.

ثم اغمر الشريحة في 15 مللي مولار أسيتات الصوديوم مع 0.1٪ توين لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإعداد 150 مللي مولار من الصوديوم الطازج لكل يودات في 15 مللي مولار من أسيتات الصوديوم ، ونقله إلى حوض غسيل منزلق ، احفظه في الثلاجة ، وتجنب الضوء حتى الاستخدام. قم بإزالة الشريحة من المخزن المؤقت لأسيتات الصوديوم وضعها في الحوض الذي يحتوي على نقاء الصوديوم الطازج بحيث يكون جانب الجسم المضاد متجها لأعلى.

قم بتغطية الحوض بورق الألمنيوم لتجنب الضوء. ثم ضع حوض الانزلاق على أربع درجات مئوية مع رج لطيف لمدة ساعتين. قم بإزالة الشريحة من الحوض واشطفها لفترة وجيزة في محلول أسيتات الصوديوم ثلاث مرات لمدة خمس دقائق.

احتضن الشريحة في 300 مل من محلول حجب حمض الجلوتاميك المحضر حديثا 10 ملليمولار في غرفة حضانة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. قم بإزالة الشرائح من الغرفة واغسلها باستخدام PBS مع 0.1٪ توين لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، في حوض غسيل منزلق ، احتضان شريحة المصفوفة الدقيقة في 300 مل من 1٪ BSA في PBS مع 0.5٪ توين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.

اشطف الشرائح في PBS مع 0.1٪ tween ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق. ضع الشريحة على رف الشرائح وقم بالتدوير عند 1 ، 200 مرة G لمدة دقيقتين لتجفيف شريحة المصفوفة الدقيقة بعد ذلك. لفصل كل مصفوفة سوبار ، يتم طباعة شبكة شمع على الشريحة.

بعد التسخين المسبق لبصمة الشمع عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، قم بتحميل شريحة المصفوفة الدقيقة المحظورة في طابعة الشمع بحيث يكون جانب الجسم المضاد متجها نحو الشمع. اسحب المقبض برفق لبصمة الشمع بالتساوي على الشريحة. يمكن استخدام هذه الطريقة لإجراء فحوصات التنميط الجليكو لعينة واحدة أو لقياس حاتمة جليكو واحدة في عينات متعددة.

سنوضح هنا فحوصات التنميط الجليكو. ابدأ بتخفيف 40 ميكرولتر من المصل إلى 360 ميكرولتر من PBS يحتوي على 0.1٪ من الجسر 0.1٪ 35 و 100 ميكروغرام لكل مليلتر ، كل من الفأر والجرذان والأرانب والماعز والحمار IgG. هذا الحجم كاف لتطبيق ستة ميكرولترات من محلول المصل المخفف على كل مجموعة فرعية.

قم بتطبيق ستة ميكرولترات من العينة المخففة أو عنصر التحكم بعناية على كل مصفوفة فرعية من الشريحة. احتضن الشريحة في كاسيت مرطب مع مناشف ورقية مبللة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اشطف الشريحة باستخدام PBS مع 0.1٪ tween ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق.

ثم جفف الشريحة عن طريق تدويرها عند 1200 مرة جم لمدة دقيقتين. قم بإعداد 20 ميكرولترا من بروتينات ربط الجليكان الحيوية بمعدل 10 ملليغرام لكل مليلتر في PBS tween في أنبوب fuge دقيق سعة 0.8 مل على الجليد. ضع ستة ميكرولترات من الليكتين البيوتينيل المخفف على كل مجموعة فرعية من الشريحة واحتضنه في صندوق الشرائح المرطب باستخدام مناشف ورقية مبللة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد شطف الشرائح باستخدام PBS مع 0.1٪ tween ثلاث مرات كما كان من قبل ، قم بتجفيف الشريحة عن طريق تدويرها عند 1200 مرة G في جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين. قم بإعداد 400 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر DITE 5 49 المسمى النيوت ترافين في PBS 0.1٪ tween في أنبوب fuge دقيق سعة 0.8 ملليلتر على الجليد. استخدم ماصة متكررة لتطبيق ستة ميكرولترات من DITE 5 49 المسمى المحايد على كل مصفوفة فرعية واحتضان الشريحة في كاسيت الشريحة المرطب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بعد الحضانة.

اشطف الشريحة باستخدام PBS 0.1٪ tween ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق. جفف الشريحة عن طريق تدويرها عند 1200 مرة G في جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين. امسح الشريحة ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي للمصفوفة الدقيقة الفلورية بدقة 10 ملم.

يجب أن تكون إعدادات الليزر و PMT قوية قدر الإمكان مع ضمان عدم ملاحظة أي تشبع. افتح الصورة في المصفوفة Pro 3.2. قم بإعداد قالب المصفوفة وفقا لخريطة المصفوفة التي تعرض مواقع بقعة الأجسام المضادة.

قم بمحاذاة كل دائرة قالب بعناية على البقعة المقابلة في الصورة ، واستخرج كثافة كل بقعة في ملف Excel لمزيد من التحليل. مصفوفة دقيقة للأجسام المضادة تحتوي على 48 مصفوفة سوبار متطابقة مع 26 أجساما مضادة ضد 20 بروتينات سكري في الدم والبيوتين. تم تصميم BSA وتصنيعه كما هو موضح في هذا الفيديو لفحص أهمية إجراء الحظر.

في تحليل توصيف البروتين السكري ، تم إنشاء شريحتين متطابقتين من المصفوفات الدقيقة. لم يتم حظر أحدهما كيميائيا بينما كان الآخر عبارة عن عينة تحكم تم تطبيقها على مصفوفات سوبار في العمودين الأول والثالث وتم تطبيق عينة مصل HCC مجمعة على مصفوفات سوبار. في العمودين الثاني و 4 22.

ثم تم تطبيق الليكتينات البيوتينيل الخاصة بالجليكان المختلفة على كل مصفوفة فرعية كما هو موضح في هذه الصور لمصفوفات سوبار. يرتبط الليكتينات بالتقاط الأجسام المضادة في أعمدة التحكم مما يعطي خلفية عالية لا يمكن تمييزها عن الأعمدة المحملة بالمصل في المصفوفات الدقيقة غير المسدودة. ومع ذلك ، عندما تم إجراء نفس التجربة على شريحة مصفوفة دقيقة للأجسام المضادة مسدودة كيميائيا ، لم يكن هناك ارتباط أو ارتباط منخفض جدا لالتقاط الأجسام المضادة في أعمدة التحكم وارتباط مستضد عالي في الأعمدة المحملة بالمصل.

توضح هذه النتائج أن إجراء الحجب الكيميائي هو خطوة حاسمة لقياس الجليكان على البروتينات السكرية التي تم التقاطها بالأجسام المضادة باتباع البروتوكول ، يمكن الحصول على ملامح الارتباط بالجليكوزيل ل 22 بروتينا سكري في مصل HCC بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. قد تفقد الأجسام المضادة عند تعديلها صلاتها مع مستضداتها وخصائصها الأخرى.

لذلك من المهم أن تضع ذلك في الاعتبار واستخدام العديد من الأجسام المضادة المختلفة في مصادر مختلفة من الأجسام المضادة باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء تدابير أخرى مثل الكشف عن كل تركيز من البروتين باستخدام نفس شريحة الأشعة الدقيقة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان تغيير الارتباط بالجليكوزيل ناتجا عن تغير مستويات التعبير عن البروتين أو فقط بسبب تغيير الارتباط بالجليكوزيل على كل بروتين على حدة. لا تنس أن العمل مع عينات مصل الدم التي تحتوي على مسببات الأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.