إجراءات واستراتيجيات التحسين الرئيسية لأسلوب الآلي المناعة شعرية المستندة إلى الغرواني الكهربي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار المقايسة المناعية للرحلان الكهربائي الشعري باستخدام منصة تجارية. ستميز هذه المنصة أهداف البروتين وتكميتها عن عينة بيولوجية يمكن الحصول عليها من أنسجة زراعة الخلايا والسوائل الحيوية. تفحص العملية البروتين بناء على الحجم الذي يتراوح من اثنين إلى 440 كيلودالتون.

تتمثل ميزة هذا الإجراء الآلي على الإجراءات التقليدية ، مثل اللطخة الغربية ، في أن المقايسات المناعية الكهربية الشعرية تلغي الحاجة إلى المواد الهلامية وأجهزة النقل والغسيل اليدوي. كما أن الكمية المطلقة من البروتين المطلوبة أقل بحوالي 10 مرات ، مما يجعل الإجراء مثاليا لأنواع الخلايا النادرة أو العينات المحدودة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الحصول على النتائج في أقل من ثلاث ساعات باستخدام الأنظمة الآلية وقد ثبت أنها أكثر كمية وقابلية للتكرار من إجراءات اللطخة الغربية التقليدية.

قم بإعداد العينات والكواشف من المجموعة ، بما في ذلك المخزن المؤقت للعينة ، و dithiothreitol ، ومزيج الفلورسنت الرئيسي ، والسلم البيوتينيل وفقا لإدراج منتج الشركة المصنعة. تحضير عينات البروتين بطريقتك المفضلة. هنا قمنا بعزل مستخلص الخلية الكاملة من مزارع خلايا BEAS-2B.

تمييع عينات البروتين باستخدام عينة عازلة. امزج جزءا واحدا من المزيج الرئيسي الفلوري خمسة مع أربعة أجزاء عينة مخففة لتحقيق تركيز البروتين النهائي المطلوب. يتم عرض مثال على حساب لصنع 70 ميكرولترا من 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر تركيز البروتين النهائي بدءا من تركيز مخزون البروتين البالغ 1.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر.

المزيج الرئيسي هو 1/5 من الحجم الكلي ، في هذه الحالة ، 14 ميكرولترا. لحساب حجم مخزون البروتين المطلوب ، اضرب التركيز النهائي المطلوب في الحجم الكلي واقسمه على تركيز مخزون البروتين. اطرح المزيج الرئيسي وأحجام المخزون من الحجم الإجمالي لحساب حجم المخزن المؤقت للعينة.

قم بتغيير طبيعة العينات المحضرة والسلم عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لاحظ أن بعض البروتينات قد تتطلب ظروفا أكثر رقة لتغيير الطبيعة. على سبيل المثال ، 70 درجة لمدة 10 دقائق لمنع تراكم البروتين وتحسين الهجرة.

ضع في اعتبارك هذا الخيار إذا كان هناك تلطيخ ثقيل في الأوزان الجزيئية الأعلى. تحضير تخفيفات الأجسام المضادة المطلوبة في المخفف المقدم. لاحظ أن الأجسام المضادة تستخدم بشكل عام بتركيزات أعلى للمقايسة المناعية القائمة على الشعيرات الدموية مقارنة بالنشاف الغربي التقليدي.

تحضير خليط واحد لواحد من اللومينول والبيروكسيد طازجا مع كل استخدام. قم بضرب العينات والكواشف في لوحة الفحص باستخدام وحدات التخزين الموضحة في القالب. يمثل الترميز اللوني التحميل المناسب للكواشف والعينات على لوحة الفحص.

البيوتينيل الماصة إلى البئر A1 ، أعدت عينات إلى الآبار A2 إلى A25. المخفف للأجسام المضادة المتوفرة للآبار B1 إلى B25 والبئر C1. الجسم المضاد الأولي للآبار C2 إلى C25. ستربتافيدين HRP إلى بئر D1. الجسم المضاد الثانوي للآبار من D2 إلى D25.

ومزيج اللومينول بيروكسيد إلى الآبار E1 إلى E25. أضف عازلة الغسيل إلى الصفوف الثلاثة الأولى من الآبار الكبيرة ذات الصفيحة الوسطى. قم بتشغيل أداة المقايسة المناعية الشعرية وافتح البرنامج المصاحب.

قم بتحميل الخرطوشة الشعرية ولوحة الفحص في الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وابدأ التشغيل. عند اكتمال التشغيل ، تحقق من تحديد معايير الفلورسنت بشكل صحيح وتصحيحها إذا لزم الأمر. بالإضافة إلى ذلك ، تحقق من أن السلم الحيوي يظهر قمم التحجيم الصحيحة للمجموعة المستخدمة.

راجع الدليل المرجعي السريع للشركة المصنعة أو دليل المنتج لمزيد من التفاصيل. يعد تحسين ظروف الفحص مثل وقت التعرض وتركيز البروتين وتخفيف الأجسام المضادة أمرا مهما للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. هذه الشروط خاصة بكل مجموعة من الأجسام المضادة للنظام النموذجي ، وبالتالي ، يجب تحديدها تجريبيا لكل اختبار جديد.

تعتمد القدرة على توليد نتائج كمية على تحليل وقت التعرض الذي لا يتم فيه استنفاد ركيزة اللومينول بسرعة ، حيث يؤدي استنفاد الركيزة إلى فقدان الإشارة أو نضوب الإشارة. يمكن تحديد ذلك من خلال فحص البيانات في أوقات التعرض المختلفة للتلألؤ الكيميائي كما هو موضح في الشكل الثاني. تراوحت فترات التعرض باستخدام الأداة المستخدمة من خمس إلى 480 ثانية.

أظهرت مناظر اللين انخفاضا في تركيزات البروتين لمستخلصات BEAS-2B التي تم فحصها باستخدام الجسم المضاد p53 DO-1 عند تخفيف واحد إلى 500. يتم تركيب معاملات إشارة التلألؤ الكيميائي التي تم الإبلاغ عنها كارتفاعات ذروة في برنامج الجهاز. يتم ضبط شدة النطاقات المرئية تلقائيا بواسطة الأداة ولا يمكن مقارنتها من لوحة إلى أخرى.

ينخفض معامل الإشارة مع التعريضات الطويلة بالتتابع إذا استنفد اللمينول ، كما هو موضح هنا. تبدأ الإشارة في الاختفاء وتنقسم الذروة عند أطول تعرضين. لهذا السبب ، تم اختيار وقت تعرض قصير يبلغ 15 ثانية لتحليل البيانات.

يجب أيضا تحسين إجمالي مدخلات البروتين لكل نظام اختبار ونموذج معين. للتقييم الكمي ، يجب إجراء القياسات ضمن النطاق الديناميكي الخطي لكل فحص. حيث تتناسب التغييرات في الإشارة ، كما تم قياسها حسب منطقة الذروة ، مع التغيرات في كمية البروتين في العينة.

يظهر معايرة التحليل الحجمي للتحليل الحجمي مناظر حارة محللة BEAS-2B عند فحصها باستخدام جسم مضاد واحد إلى 500 p53 DO-1 أو واحد إلى 50 جسما مضادا ألفا توبولين. يؤكد تحليل الانحدار الخطي أن المقايسات خطية على النطاق بأكمله الذي تم اختباره. تم اختيار إجمالي تركيزات البروتين في منتصف النطاق الخطي لاستيعاب التباين المحتمل في البروتين المستهدف في أي من الاتجاهين.

كاعتبار نهائي للتحسين ، يجب تقييم التخفيف المناسب للأجسام المضادة الأولية. يساعد استخدام الأجسام المضادة بتركيزات خياطة على ضمان أن أي تغييرات في الإشارة تم قياسها ترجع فقط إلى التغيرات في كمية البروتين. تم فحص عينتين من بروتين BEAS-2B ، ممثلة بالنقطتين الزرقاء والبرتقالية ، بجسم مضاد ألفا توبولين مخفف متسلسلا.

تم رسم إشارة التلألؤ الكيميائي ، التي تم قياسها كمنطقة ذروة ، ضد تخفيف الأجسام المضادة. لوحظ التشبع بالقرب من التخفيف من واحد إلى 50 ، حيث يبدأ المنحنى في هضبة ملحوظة. لذلك تم اختيار واحد إلى 50 كتخفيف مثالي لهذا الجسم المضاد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تشعر بالراحة في إعداد العينات وتحميل العينات وتنفيذ التحليل على أداة المقايسة المناعية القائمة على الشعيرات الدموية ProteinSimple Wes. بمجرد إتقان هذا الإجراء ، يمكن إجراء التشغيل بالكامل في ثلاث ساعات مع 25 عينة. عند تحليل الجري ، من المهم إجراء مراقبة الجودة لكل شعيرات دموية وعينة.

وهذا يشمل التحقق من معايير الفلورسنت في سلم البيوتينيل. إذا تم تحديد القمم بشكل غير صحيح ، فيجب استخدام برنامج التحليل لتحديد القمم الصحيحة بشكل أساسي والقضاء على القمم المحددة بشكل غير صحيح. كما هو الحال مع جميع تقنيات البيولوجيا الجزيئية في المختبر ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة لحماية نفسك وعيناتك.

وهذا يشمل معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة والأحذية المغلقة. من المهم أن تضع في اعتبارك أنه يجب إجراء التحسين لكل هدف جديد يتم قياسه أو عند استخدام مصادر عينات مختلفة. تشمل خطوات التحقق والمتابعة تقييم خصوصية الجسم المضاد والإشارة باستخدام البروتين المنقى أو الحاتمة.

اختبار النطاق الديناميكي للمقايسة باستخدام سلسلة من تخفيفات العينة وتحسين تخفيف الأجسام المضادة عن طريق تقييم تشبع الإشارة على نطاق تركيز الجسم المضاد. بمجرد تحسينه ، يجب أن يوفر هذا الإجراء المناعي الشعري طريقة أكثر سرعة وكمية لقياس البروتين المستهدف للعينات البيولوجية مقارنة بالطرق التقليدية مثل اللطخة الغربية.