إعادة برمجة الابتدائي السائل السلوى وغشاء الخلايا بلوريبوتينسي في ظروف خالية من كرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو اشتقاق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات بكفاءة عن طريق إعادة البرمجة فوق الكروموسومية من نوعين مختلفين من الخلايا الجذعية الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توفير مصدر للخلايا الجذعية متعددة القدرات لهندسة الأنسجة، أو نمذجة الأمراض، أو الأبحاث الأساسية، أو الدراسات الطولية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن إعادة البرمجة وإنضاج الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) يتم في ظروف محددة كيميائياً، مع إمكانية توفرها مبكراً لعلاجات الأطفال المحتملة القائمة على الخلايا.

سيقوم ستيفن مكليلان، الباحث الرئيسي، وأنا بتوضيح هذا الإجراء. احصل على المشيمات في أسرع وقت ممكن بعد الولادة. اقطع جزءاً من الغشاء السلوي بمساحة تسعة سنتيمترات مربعة، واغسله في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليمتر باستخدام 30 مليلتر من PBS المضاف إليه محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات.

قم بإزالة تجلطات الدم من الأغشية، ثم استخدم زوجاً من المشرط الدقيق لتقطيع الأغشية إلى قطع صغيرة في طبق زراعة أنسجة معقم بقطر 10 سنتيمتر. استخدم شفرات المشرط لنقل كتلة نسيج الغشاء المقطع إلى أنبوب تفكيك أنسجة واحد يحتوي على 4.7 milliliters من وسط RPMI-1640. اخلط إنزيمات التفكيك.

ثبّت الأنبوب على جهاز تفكيك الأنسجة، وقم بتشغيل البرنامج h_tumor_01. ثم حضّن الأنبوب عند 37 °C على منصة هزازة لمدة 30 دقيقة. قم بتخفيف المعلق بشكل أكبر بإضافة 35 mL من RPMI-1640، ثم مرره عبر مصفاة بمسامية 70 micron موضوعة فوق أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL.

قم بإجراء عملية الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 ×g في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من السائل الطافي، أعد تعليق الراسب في خمسة مليلتر من RPMI-1640، وقم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ازرع الخلايا في تجمعات خلوية بكثافة تقارب 10,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في دوارق زراعة الأنسجة تحتوي على وسط AFMC المحضر حديثاً والمضاف إليه محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات.

قم بحصاد الخلايا الجذعية من السائل السلوي والغشاء السلوي ذات عدد الممرات المنخفض لإعادة البرمجة من قارورة T75 واحدة عن طريق إضافة 2 mL من إنزيم فصل الخلايا إلى طبقة الخلايا. يتم التحضين عند 37 °C لمدة تتراوح من 5 إلى 8 دقائق. وبعد الطرد المركزي عند 200 ×g لمدة 45 دقيقة، أعد تعليق الراسب في 1 mL من PBS، وامزجه جيدًا لغسل مكونات المصل.

قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ثم اضبط كثافة الخلايا لتصبح 100,000 خلية لكل milliliter من PBS، ووزعها على أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في أنابيب بوليسترين سعة خمسة milliliter للسماح بعملية الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي عادي ذو دوارة متأرجحة، ثم قم بالطرد المركزي عند 200 ×g لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد عملية الطرد المركزي، اقلب الأنابيب وتخلص من السائل الطافي في حاوية النفايات، ثم قم بخطوة طرد مركزي إضافية عند 200 ×g لمدة ثلاث دقائق. بعد انتهاء الدوران، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لسحب السائل المتبقي من الأنابيب بعناية. ضع رؤوس نقل الجينات، والأنبوب، ومحلول إعادة التعليق، والمحلول الإلكتروليتي داخل كابينة زراعة الأنسجة.

قم بتقريب جهاز عفن الخلايا (transfection) بحيث يمكن وضع محطة الأنابيب الخاصة به مباشرة داخل الكابينة. املأ أنبوب عفن خلايا واحد بثلاثة ملليلترات من المحلول المنظم الإلكتروليتي، وثبّت الأنبوب في المحطة بدفعه بالكامل داخل الفتحة. أخرج حصص محلول بلازميد إعادة البرمجة المُحضرة مسبقاً من وحدة التخزين عند درجة حرارة 80- درجة مئوية، واتركها لتذوب في درجة حرارة الغرفة داخل كابينة الزرع.

اضبط معاملات transfection على الجهاز لإرسال نبضة واحدة لمدة 40 milliseconds بجهد 950 volts. أعد تعليق الراسب الذي يحتوي على 100, 000 خلية في 10 µL من محلول resuspension buffer. وبسرعة، أضف 1/10 من محلول reprogramming plasmid إلى الخلايا المعاد تعليقها.

قم بتركيب طرف عملية ترانسفكشن (transfection) على ماصة الترانسفكشن. ثم اسحب معلق الخلايا إلى طرف الترانسفكشن مع مراعاة تجنب تكوين فقاعات هوائية بدقة. أدخل ماصة الترانسفكشن في أنبوب الترانسفكشن.

ثم اضغط على زر البدء الموجود على شاشة جهاز ترنسفكشن (transfection). انتظر ظهور الرسالة على الشاشة التي تفيد بنجاح عملية الترنسفكشن. بعد ذلك، قم بإزالة الماصة من الأنبوب فوراً.

قم بتفريغ المعلق في عين واحدة من أطباق الست عيون المستهدفة. اخلط المعلق مع الوسط الموجود في العين المجاورة، ثم وزع المعلق بالتساوي على كلتا العينين. كرر عملية عفن الخلية (transfection) لكل أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على خلايا.

ابدأ بإضافة 30 µL من 0.5 mM EDTA وPBS إلى خمسة أنابيب PCR. بعد ذلك، ركب طرفاً على ماصة 10 µL مضبوطة على مقدار 2 µL. ثبت طرف الماصة بزاوية عند حافة المستعمرة، ثم اكشط المستعمرة بأكملها عن السطح بعناية وبشكل تدريجي.

قم بسحب المستعمرة بأكملها فوراً إلى رأس الماصة، وانقلها إلى أحد أنابيب PCR المجهزة بـ EDTA. بعد تكرار العملية مع أربع مستعمرات أخرى، يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من أربع إلى ست دقائق. استخدم رأس ماصة أكبر لسحب كل معلق خلوي للأعلى وللأسفل بلطف لتفكيك المستعمرة إلى كتل أصغر.

تجنب تحويل الخلايا إلى معلق أحادي الخلية. ثم قم بتوزيع المعلق مباشرة في البئر المستهدف من طبق يحتوي على 24 بئراً ومغلف ببروتين vitronectin المؤتلف. بعد تكرار العملية لبقية المستعمرات، قم بالتحضين لمدة تتراوح من ثلاثة إلى ستة أيام.

بعد مرور أربعة إلى ستة أيام، عندما تنمو المستعمرات وتصبح متراصة، اغسل صفائح الخلايا بـ 300 µL من 0.5 mM EDTA، ثم قم بشفط المحلول على الفور. بعد ذلك، أضف 300 µL أخرى، واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد شفط EDTA، اضبط ماصة سعة 1 mL على أقصى سعة لها، وركب عليها طرفاً عريض الفتحة سعة 1 mL، ثم اشفط وسط E8 من البئر المستهدف في طبق سداسي الفتحات مطلي بـ vitronectin.

قم بتوجيه تدفق من الوسط إلى بئر واحدة من لوحة المصدر لغسل مستنبت الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). ثم انقل المعلق إلى البئر المستهدفة، وقم بسحب السائل ودفعه بالماصة عدة مرات لتفتيت المستعمرات إلى تجمعات تتكون من 20 إلى 40 خلية. بعد توزيع جميع الخلايا، تأكد من توزيع التجمعات بشكل متساوٍ عن طريق هز اللوحة ورجّها برفق.

ثم أعد الطبق إلى الحاضنة لالتصاق التكتلات ونمو المستعمرات. تُظهر الخلايا الجذعية للسائل الغشائي والسلى، والتي تمثل الخلايا المصدر لإعادة البرمجة، شكلاً مغزلياً نموذجياً ممتداً ومضيئاً تحت مجهر تباين الأطوار. تكتسب الخلايا خصائص ظهارية بعد خضوعها لعملية الانتقال من الميزنشيم إلى الظهارة، مما يؤدي إلى تكوين مستعمرات من خلايا تشبه أحجار الرصف.

تتكاثر هذه المستعمرات وتكون كتلًا خلوية غير منتظمة من خلايا MET. وفي المراحل اللاحقة من إعادة البرمجة، تظهر مستعمرات من خلايا أعيدت برمجتها بالكامل، وهي عبارة عن خلايا يمكن تمييزها بشكل فردي ولها حدود واضحة. وتتواجد هذه الخلايا المعاد برمجتها بالكامل جنبًا إلى جنب مع مستعمرات MET التي تكون أكثر عددًا.

يظهر هنا مستنسخ ناضج معزول تمت إعادة برمجته بالكامل. بعد اشتقاق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ونضجها، يمكن إخضاعها لتوصيف تفصيلي، وتوجيه تمايزها إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. لا تنسَ أن العمل مع الأنسجة البشرية التي لم يتم اختبارها للكشف عن وجود مسببات الأمراض يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية، والعمل داخل كابينة السلامة البيولوجية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحفيز تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية، وما هي الكواشف والأجهزة المستخدمة، وكيفية استزراع الخلايا الجذعية متعددة القدرات بشكل روتيني.