إعادة برمجة الابتدائي السائل السلوى وغشاء الخلايا بلوريبوتينسي في ظروف خالية من كرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو اشتقاق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات بكفاءة عن طريق إعادة البرمجة العرضية من نوعين مختلفين من الخلايا الجذعية الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توفير مصدر للخلايا الجذعية متعددة القدرات لهندسة الأنسجة أو نمذجة الأمراض أو الأبحاث الأساسية أو الدراسات الطولية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن إعادة برمجة ونضج iPSCs يحدث في ظروف محددة كيميائيا بينما تكون متاحة مبكرا للعلاجات المحتملة القائمة على خلايا الأطفال.

سيظهر هذا الإجراء ستيفن ماكليلان ، الباحث الرئيسي ، وأنا. الحصول على المشيمة في أسرع وقت ممكن بعد الولادة. قم بقص جزء من السلى بحجم تسعة سنتيمترات مربعة ، واغسله في أنبوب طرد مركزي بطول 50 ملم مع 30 مل من PBS مكمل بالمضادات الحيوية ومحلول مضاد للفطريات.

قم بإزالة جلطات الدم من الأغشية ، ثم استخدم زوجا من المشارط الدقيقة لفرم الأغشية إلى قطع رفيعة في طبق زراعة أنسجة معقم يبلغ طوله 10 سم. استخدم شفرات المشرط لنقل كتلة أنسجة الغشاء المفروم إلى أنبوب واحد لتفكك الأنسجة يحتوي على 4.7 مل من وسط RPMI-1640. امزج إنزيمات التفكك.

قم بتركيب الأنبوب على مفكك الأنسجة ، وقم بتشغيل البرنامج h_tumor_01. ثم احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية على منصة هزازة لمدة 30 دقيقة. قم بتخفيف التعليق بمقدار 35 مل من RPMI-1640 ، وقم بتطبيقه على مصفاة 70 ميكرون موضوعة فوق أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.

جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 200 مرة جم في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من RPMI-1640 ، وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بزرع الخلايا في مجموعات الخلايا بكثافة تقارب 10،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في قوارير زراعة الأنسجة باستخدام وسط AFMC المحضر حديثا مكملا بالمضادات الحيوية ومحلول مضاد للفطريات.

حصاد عدد ممر منخفض للسائل الأمنيوسي والخلايا الجذعية الغشائية لإعادة البرمجة من قارورة T75 واحدة عن طريق إضافة ملليلترين من إنزيم انفصال الخلية إلى ورقة الخلية. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ثماني دقائق. بعد الطرد المركزي عند 200 مرة جم لمدة 45 دقيقة ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS ، واخلطها جيدا لغسل مكونات المصل.

عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. ثم اضبط كثافة الخلية على 100 ، 000 خلية لكل مليلتر من PBS ، والآن رباعي في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في أنابيب البوليسترين سعة خمسة ملليلتر للسماح بالطرد المركزي في دفة متأرجحة منتظمة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 مرة جم لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الدوران ، اقلب الأنابيب ، وتخلص من المادة الطافية في حاوية نفايات ، ثم قم بإجراء خطوة طرد مركزي إضافية عند 200 مرة جم لمدة ثلاث دقائق. بعد الدوران ، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط السائل المتبقي من الأنابيب بعناية. ضع أطراف النفقة والأنبوب والمخزن المؤقت لإعادة التعليق والمخزن المؤقت الإلكتروليتي في خزانة زراعة الأنسجة.

حرك جهاز التعدي بالقرب من ذلك بحيث يمكن وضع محطة الأنبوب. املأ أنبوب تعداء واحدا بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت الإلكتروليتي ، وقم بتركيب الأنبوب في المحطة عن طريق دفعه بالكامل داخل الفتحة. خذ الحصص المعدة مسبقا لإعادة برمجة محلول البلازميد من التخزين البالغ 80 درجة مئوية تحت الصفر ، واتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة في خزانة الزاعفة.

اضبط معلمات التعداء على الجهاز لتوصيل نبضة واحدة مدتها 40 مللي ثانية عند 950 فولت. أعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على 100 ، 000 خلية في 10 ميكرولتر من مخزن مؤقت لإعادة التعليق. العمل بسرعة ، أضف 1/10 من محلول البلازميد المعاد برمجته إلى الخلايا المعلقة.

قم بتركيب طرف الإرسال على ماصة الإرسال الترانسفيكشن. ثم استنشق معلق الخلية في طرف التعدي بعناية وتجنب تكوين فقاعات الهواء. أدخل ماصة التعداء في أنبوب التعداد.

واضغط على زر البدء على الشاشة في جهاز التعداد. انتظر رسالة الشاشة المتعلقة بنجاح التعداد. ثم قم بإزالة الماصة من الأنبوب على الفور.

طرد التعليق في بئر واحد من الألواح المستهدفة المكونة من ستة آبار. امزج الوسط من بئر مجاور ، ووزع التعليق بالتساوي في كلا البئرين. كرر التعداء لكل أنبوب طرد مركزي دقيق مع الخلايا.

ابدأ بإضافة 30 ميكرولتر من 0.5 مللي مولار EDTA و PBS إلى خمسة أنابيب PCR. ثم قم بتحميل طرف على ماصة سعة 10 ميكرولتر مضبوطة على اثنين من الميكرولتر. أمسك طرف الماصة بزاوية عند حافة المستعمرة ، واكشط المستعمرة بأكملها بعناية وتدريجيا عن السطح.

بشفط المستعمرة بأكملها على الفور إلى طرف الماصة ، وانقلها إلى أحد أنابيب PCR المعدة باستخدام EDTA. بعد تكرار العملية مع أربع مستعمرات أخرى ، احتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع إلى ست دقائق. استخدم طرف ماصة أكبر لتعليق كل خلية لأعلى ولأسفل برفق لتقسيم المستعمرة إلى كتل أصغر.

تجنب إنشاء تعليق أحادي الخلية. ثم ضع التعليق مباشرة في البئر المستهدف للوحة 24 بئرا مطلية بفيترونكتين مؤتلف. بعد تكرار العملية للمستعمرات المتبقية ، احتضن لمدة ثلاثة إلى ستة أيام.

بعد أربعة إلى ستة أيام ، عندما تنمو المستعمرات وتصبح مضغوطة ، اغسل صفائح الخلايا ب 300 ميكرولتر من 0.5 مللي مولار EDTA ، واستنشق على الفور. ثم أضف 300 ميكرولتر أخرى ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد شفط EDTA، اضبط ماصة سعة ملليلتر واحد على السعة، وقم بالتركيب على طرف تجويف بعرض مليلتر واحد، واستنشق وسط E8 من البئر المستهدف لصفيحة ستة آبار مطلية بفيتامين برونكتين.

رش تيار من الوسط في بئر واحد من لوحة المصدر لغسل ثقافة iPSC. ثم انقل المعلق إلى بئر الهدف ، وقم بتقطيع الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت المستعمرات إلى كتل من 20 إلى 40 خلية. بعد طلاء جميع الخلايا ، تأكد من توزيع الكتل بالتساوي عن طريق هز اللوحة برفق وهزها.

ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة للتصاق التكتل ونمو المستعمرة. تعرض الخلايا الجذعية السائلة السلوية والغشائية ، التي تمثل خلايا المصدر لإعادة البرمجة ، مورفولوجيا نموذجية لللحمة المتوسطة ممدودة ومشرقة الطور. تكتسب الخلايا خصائص ظهارية بعد خضوعها للانتقال من اللحمة المتوسطة إلى الظهارية ، مما يؤدي إلى تكوين مستعمرات ذات خلايا تشبه الحصى.

تتكاثر هذه المستعمرات وتخلق كتلا خلوية غير منتظمة من خلايا MET. في المراحل اللاحقة من إعادة البرمجة ، تظهر مستعمرات من الخلايا المعاد برمجتها بالكامل ، خلايا يمكن تمييزها بشكل فردي ذات حدود محددة جيدا. هذه الخلايا المعاد برمجتها بالكامل موجودة جنبا إلى جنب مع مستعمرات MET التي هي أكثر عددا.

عرض استنساخ ناضج معزول معاد برمجته بالكامل هنا. بعد اشتقاق iPSC والنضج, يمكن أن تخضع لتوصيف التفاصيل, وتوجيه التمايز إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية التي لم يتم اختبارها بحثا عن وجود مسببات الأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية والعمل في خزانة السلامة الحيوية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية ، وما هي الكواشف والمعدات التي يجب استخدامها ، وكيفية زراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات بشكل روتيني.