عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا السلفية البطانية من دم الحبل السري البشري. تصف هذه الطريقة عزل الخلايا السلفية البطانية عن دم الحبل السري لاستخدامها المحتمل كخلايا ذاتية لهندسة أنسجة الطعوم الوعائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء العزل في وسائط متخصصة دون الحاجة إلى أي فرز أميني.

يمكن استخدام الخلايا السلفية البطانية المعزولة لدراسة الأوعية الدموية الجديدة ، وأشارت التقارير أيضا إلى أنه يمكن استخدام هذه الخلايا كمؤشرات حيوية لتحديد المرضى المعرضين لخطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية. قبل البدء في إجراء العزل ، قم بتغطية ستة أطباق جيدا مسبقا بملليلترين من ذيل الفئران المحضر حديثا محلول كولاجين واحد لكل بئر. قم بموازنة اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة على الأقل.

ثم قم بتخفيف ما يقرب من 25 مل من دم الحبل السري باستخدام HBSS بتركيز واحد لواحد. بعد ذلك ، أضف 20 مل من كاشف متوسط التدرج الكثافة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، وقم بتوزيع 20 مل من دم الحبل السري المخفف بعناية أسفل جدار الأنبوب لوضع الدم على الوسط. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بإزالة طبقة البلازما بعناية.

باستخدام حقنة مزودة بإبرة قياس 18 ، اجمع الخلية أحادية النواة التي تحتوي على طبقة مصفرة في أنبوب جديد سعة 50 مل. وأضف حجما متساويا من الوسط القاعدي البطاني إلى الخلايا. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي وقم بتحلل خلايا الدم الحمراء في الحنك الناتج بخمسة ملليلتر من محلول كلوريد الأمونيوم على الجليد.

بعد خمس إلى 10 دقائق مع الاهتزاز العرضي ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات البيضاء في وسط نمو البطاني الجديد. بعد العد ، قم بشفط الكولاجين من كل بئر من لوحة الآبار الستة ، واغسل الآبار ثلاث مرات في PBS. قم بزرع الخلايا أحادية النواة في خلية واحدة في 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من الوسط لكل تركيز بئر.

وأعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، اشطف الخلايا مرة واحدة بوسط نمو البطاني الجديد. ثم استبدل الغسيل بثلاثة ملليلتر من وسط نمو البطانة الطازجة ، وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا.

باستخدام مجهر المجال الساطع ، احصل على صور يومية للخلايا لمراقبة تطور مستعمرات الخلايا البطانية ، وتحديد الصفائح التي تنشأ فيها المستعمرات لتتبع نموها. عندما يصل حجم مستعمرات الخلايا البطانية إلى حوالي ثلاثة ملليمترات ، قم بتغطية قارورة ثقافة T25 بذيل الفئران الطازج كولاجين واحد لمدة ساعة واحدة على الأقل في حاضنة زراعة الخلايا. ثم حصاد الخلايا ب 150 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA لكل بئر في حاضنة زراعة الخلايا لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

النقر برفق على اللوحة لإخراج الخلايا المرفقة. عندما تبدأ الخلايا في الانفصال ، أضف على الفور ملليلترين من وسط نمو البطانة الطازجة ، واسحب الخلايا في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلترا. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط نمو البطانية الطازجة.

بعد العد ، قم بزرع الخلايا في قارورة المغلفة بالكولاجين بخمس أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة في ثلاثة ملليلتر من المتوسط لكل كثافة قارورة ، وقم بتمييز القارورة على أنها ممر واحد. ثم أعد القارورة إلى الحاضنة ، وأعد زرع الخلايا كلما وصلت المستعمرة إلى 90٪ من التقاء. بعد البذر على الصفائح المعالجة بالكولاجين ، عادة ما يتم ملاحظة نمو المستعمرة الأولى بين الأيام الخامسة إلى التاسعة.

تستمر المستعمرات في النمو واكتساب مورفولوجيا خلية على شكل مغزل في المراحل الأولى من الثقافة ، والتي تتطور لاحقا إلى مورفولوجيا تشبه الحصى. يزداد العدد الإجمالي للخلايا التي يتم حصادها في كل ممر في ارتباط مباشر بإجمالي عدد الأيام في المزرعة. يكشف تحليل اللطخة الغربية عن تعبير مبكر عن CD 31 و CD 34 بواسطة الخلايا البطانية المستنبتة ، والتي يبدو أنها تنخفض مع المرور اللاحق.

ومع ذلك ، يتم الحفاظ على التعبير عن مستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي الثاني بمرور الوقت ، على الرغم من أنه عند مستوى تعبير أقل قليلا من ذلك الذي لوحظ بعد المقطع الأول. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا السلفية البطانية ليست إيجابية لعلامة الخلايا الوسيطة ألفا أكتين العضلات الملساء ، على عكس على سبيل المثال ، محللات الخلايا الخلالية الصمامية ، والتي يمكن تضمينها كعنصر تحكم إيجابي. يمكن إكمال إجراء العزل بأكمله في أقل من خمس ساعات اعتمادا على وحدة دم الحبل السري التي تم الحصول عليها.

بعد عزل الخلايا أحادية النواة وبذرها في وسط النمو البطاني ، عادة ما يستغرق الأمر ما بين خمسة وتسعة أيام حتى تظهر مستعمرات EPC في المزرعة. تستخدم طريقة العزل المقترحة وسائط متخصصة لزراعة الخلايا السلفية البطانية ، وتتجنب استخدام مقياس التدفق الخلوي ، فيما يتعلق بمتطلبات وجود علامات بطانية. توفر هذه الطريقة أيضا بروتوكولا فعالا للحصول على كميات كبيرة من الخلايا السلفية البطانية على مدى فترة زمنية قصيرة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا السلفية البطانية من وحدات دم الحبل السري البشري. لا تنس أن دم الحبل السري البشري يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب اتباع التخلص السليم من نفايات الدم ومنتجات زراعة الخلايا.