عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجموعات فرعية من الخلايا البائية السليفة من دم الحبل السري. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا أحادية النواة أولا من دم الحبل السري عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. في الخطوة الثانية ، يتم تصنيف مستضدات سطح الخلية بالأجسام المضادة المترافقة مع البيوتين لاستنفاد أي من الخلايا غير البائية المتبقية مغناطيسيا.

بعد ذلك ، يتم تمييز الخلايا البائية المعزولة بالفلورسنت بالأجسام المضادة ضد مستضدات سطح الخلية CD 19 و CD 34 و CD 45. في الخطوة الأخيرة ، يتم فرز الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي لاستعادة المجموعات الفرعية للخلايا البائية السلائف. في النهاية ، يمكن الحصول على خلايا ذات عدد وجودة كافيين لاستخدامها في فحوصات المصب التي تتطلب الحمض النووي والحمض النووي الريبي عالي الجودة.

تتمثل إحدى مزايا استراتيجية فرز الخلايا على الطرق البديلة في أن استراتيجيتنا تتطلب وقتا أقل على مقياس التدفق الخلوي وثلاثة أجسام مضادة فلورية فقط تقلل بشكل كبير من تكلفة التجربة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع مجموعة متنوعة من الطرق المتاحة لإعداد خلايا دم الحبل السري لقياس التدفق الخلوي وتعقيد إعداد مقياس التدفق الخلوي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للخلايا البائية السليفة السليمة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في دم الحبل السري مثل الخلايا التائية أو على دراسات الأمراض التي تنطوي على أي خلايا مكونة للدم مثل سرطان الدم أو سرطان الغدد الليمفاوية.

العرض البصري لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه من الصعب وصف التقنيات المناسبة المطلوبة لمعالجة دم الحبل السري والخلايا بطريقة تزيد من صلاحية الخلية وتقلل من وجود الحطام الملوث. لعزل الخلايا أحادية النواة من دم الحبل السري ، قم أولا بتخفيف ثمانية مليلتر من دم الحبل السري ب 24 مل من DPBS. ثم ضع طبقة ببطء من كل خليط دم مخفف فوق 15 مليلتر من ALI واط من فيبا بلس في أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر ، مع الحرص على إبقاء الطبقات منفصلة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للدم لمدة 40 دقيقة عند 400 مرة جم و 20 درجة مئوية بينما يتم فصل الخلايا عن طريق ملصق تدرج الكثافة سبعة أنابيب قاع مستديرة بسعة خمسة ملليلتر مع تاريخ معرف العينة وأي معلومات مناسبة أخرى كما هو موضح في الجدول. بعد الانفصال ، ستبقى الخلايا أحادية النواة عند واجهة البلازما غير الشفافة بالإضافة إلى البلازما ، في حين أن الخلايا المحببة وكريات الدم الحمراء سوف ترسب الآن لشفقت طبقات البلازما العليا ، وتجنب ملامسة طبقات الخلية أحادية النواة. ثم استخدم ماصة زجاجية سعة 10 ملليلتر لتجميع طبقات الخلية أحادية النواة بعناية من ثلاثة من الأنابيب سعة 50 مليلتر في أنبوب واحد جديد سعة 50 ملليلترا.

املأ هذا الأنبوب الجديد ب PBS ، واخلط معلق الخلية برفق ثم اغسل الخلايا مرتين لمدة 10 دقائق عند 300 مرة جم و 20 درجة مئوية. بعد الغسيل الأول ، أعد تعليق الكريات وانقلها إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل. بعد الغسيل الثاني ، قم بتعليق حبيبات الخلية برفق في 200 ميكرولتر من PBS ، ونقل ميكرولتر واحد من تعليق الخلية إلى مليلتر واحد من PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر للعد.

ثم اغسل الخلايا في أنبوب 50 مليلتر مع المزيد من PBS بعد ذلك ، وقم بإزالة المادة الطافية تماما دون إزعاج الحبيبات. لعزل الخلايا البائية عن الخلايا أحادية النواة أولا ، قم بتعليق الحبيبات المغسولة للتو في 160 ميكرولتر من أربع درجات مئوية. مخزن مؤقت للمساكن الرقمية E-D-T-A-P-B-S محضرة حديثا.

ثم امزج 40 ميكرولترا من مجموعة عزل الخلايا البائية ، وكوكتيل الأجسام المضادة الحيوية ITIN مع تعليق الخلية. بعد احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، اغسل الجسم المضاد الحر في مليلتر واحد من أربع درجات مئوية ، E-D-T-A-P-B-S لكل 10 ملايين خلية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 320 ميكرولتر من أربع درجات مئوية عازلة E-D-T-A-P-B-S.

الآن امزج 80 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة للبيوتين مع تعليق الخلية بعد حضانة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا مرة أخرى أثناء دوران الخلايا. ضع عمود LS في المجال المغناطيسي للفاصل الأقصى وقم بالتنقيط ثلاثة ملليلتر من أربع درجات مئوية من خلال العمود

بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق ما يصل إلى 100 مليون من الخلايا المغسولة في 500 ميكرولتر من أربع درجات مئوية ، عازلة E-D-T-A-P-B-S. ثم قم بعمل ماصة معلق الخلية على العمود لتجميع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. أضف ملليلترين إضافيين من أربع درجات مئوية ، E-D-T-A-P-B-S إلى جدران الأنبوب المخروطي الأصلي ، مليلتر واحد في كل مرة ثم امزج برفق وقم بخلط معلق الخلية المتبقية على العمود في كل مرة للتأكد من استعادة جميع الخلايا.

أخيرا ، املأ الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الخلايا غير المسماة ب PBS. بعد الطرد المركزي ، تقوم الخلايا بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. ثم قم بتعليق الخلايا برفق في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت E-D-T-A-P-B-S.

ابدأ وضع العلامات على الأجسام المضادة. خطوة بخطوة أولا نقل ميكرولتر واحد من تعليق الخلية إلى الأنبوب غير الملطخ المسمى مسبقا. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت E-D-T-A-P-B-S إلى الأنبوب وقم بتخزينه على الثلج.

أطفئ جميع الأنوار ثم أضف 20 ميكرولترا لكل من الأجسام المضادة CD 19 و CD 34 و CD 45 لكل 1 مليون خلية في معلق الخلية المتبقي. تخلط جيدا وتوضع الأنبوب في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، انقل 40 ميكرولترا من تعليق الخلية المسمى الجسم المضاد إلى الأنبوب المسمى سبعة A و D.

اغسل الخلايا في مليلتر واحد من PBS ثم أعد تعليق البليت في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم. أضف سبعة ميكرولترات من سبعة أ أ د إلى هذه الخلايا ثم احتضنها في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بينما يتم تمييز الخلايا بسبعة أ أ د أعلى أنبوب الخلايا المسماة بالأجسام المضادة باستخدام PBS ، اغسل الخلايا المسماة بالجسم المضاد ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت E-D-T-A-P-B-S. الآن انقل الحجم الكامل لتعليق الخلية المسمى الجسم المضاد إلى الأنبوب المسمى CD 19 الإيجابي CD 34 الموجب CD 45 الإيجابي.

اشطف الأنبوب بملليلتر إضافي واحد من المخزن المؤقت E-D-T-A-P-B-S وانقل تعليق الخلية المتبقية إلى الأنبوب المسمى الإيجابي CD 19 CD 34 الموجب CD 45. أخيرا ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط إلى الأنبوب السبعة A a D لفرز الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي MO flow XDP. قم أولا بإعداد تدفق MO للفرز ، وقم بتشغيل عناصر التحكم في التعويض المناسبة ثم قم بإنشاء بروتوكول بما في ذلك المخططات كما هو موضح في هذا الشكل.

تأكد من تشغيل نظام تفريغ الهباء الجوي في جميع الأوقات ثم استخدم العينة غير الملوثة لضبط الجهد والكسب لمخططات التشتت الأمامية والجانبية. لتحديد مجموعات التألق السلبية. اضبط العتبة على أقل من أو تساوي 1٪ حتى لا يلوث أي حمض نووي يحتوي على حطام العينات المستردة.

قم بتشغيل حوالي 50،000 حدث من القرص المضغوط 19 إيجابي CD 34 إيجابي CD 45 عينة موجبة. لتعيين استراتيجية البوابات كما هو موضح للتو ، فإن البوابات الخلفية غير الموجبة CD 19 الإيجابية CD 34 على التشتت الجانبي مقابل مخطط التشتت الأمامي. للتأكد من أن مشية الخلايا الليمفاوية تتضمن الخلايا البائية المحتملة.

استخدم هذه العينة أيضا لتعيين عدد التألق السلبي لتلطيخ سبعة أ أ د. بعد ذلك ، قم بتشغيل عينة سبعة a a d لتحديد صلاحية العينة فقط فرز الخلايا من عينة ذات جدوى أكبر من أو تساوي 95٪ في البداية حيث ستلطخ الخلايا الميتة بشكل عشوائي وقد تلوث مجموعات الفرز التي تقوم الآن بإعداد قرارات فرز لجمعها للسكان CD 19 إيجابي ، CD 34 إيجابي CD 19 إيجابي ، CD 34 سلبي CD 45 ، CD منخفض 19 إيجابي ، CD 34 سلبي CD 45 متوسط و CD 19 إيجابي. CD 34 سلبي CD 45 مرتفع.

قم بتضمين الخلايا الليمفاوية وبوابات التمييز المزدوجة في قرارات فرز جميع السكان لمنع الانسدادات. في طرف الفرز ، قم بتصفية عينة CD 19 موجبة CD 34 موجبة CD 45 من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون مباشرة قبل الفرز. ثم ضع أنابيب التجميع المصنفة المطلية بنسبة 2٪ FBS في PBS في حامل أنبوب معبأ بالثلج وفرز الخلايا في أنبوب التجميع المناسب فور اكتمال الفرز.

استخراج الحمض النووي بين تباين العينة يلعب دورا في نجاح الخلية ، وفرز في نوع جيد. هناك نسبة عالية من الخلايا في مشية الخلايا الليمفاوية. تحتوي العينات ذات معدلات النجاح الجيدة على مستويات منخفضة من الحطام الملوث كما يتضح من قلة عدد الأحداث التي تقع أسفل وإلى يسار مجموعات الخلايا الليمفاوية المسورة.

تحتوي العينات ذات معدلات النجاح الضعيفة على مستويات عالية من الحطام الملوث. تظهر العينات الضعيفة زيادة ملحوظة في هذه الأحداث. الخلايا التي تم فرز التدفق والحمض النووي اللاحق المعزول من كل مجموعة فرعية من الخلايا البائية السليفة هي ذات كمية ونوعية لإجراء تحليلات المصب.

لقد استخدمنا هذا الحمض النووي بشكل روتيني في ميرا لإثراء الحمض النووي الميثيلي هنا الحمض النووي ، المعزول من CD 19 إيجابي CD 34 خلية موجبة CD 19 إيجابي ، CD 34 سلبي CD 45 خلايا منخفضة CD 19 إيجابية ، CD 34 سلبي CD 45 خلية متوسطة و CD 19 إيجابي CD 34. تم صوتنة الخلايا العالية السلبية CD 45 على ارتفاع لمدة تسع دقائق من العمود ثم تصورها على هلام 1٪ aros مع صبغة هلام الحمض النووي الأخضر في هذا الممر. تم أيضا تشغيل سلم زوج أساسي 100 بعد ميرا باستخدام طريقة الشكل النشط ، وجمع مجموعة فائقة PCR مع التحكم في SLC 25 A 37 ، وتم إجراء جينات APC غير الميثيلة ، والتحكم في جينات واحدة لتأكيد إثراء الحمض النووي الميثيلي.

التضخيم الأعلى ل SLC 25. يؤكد A 37 إثراء الحمض النووي الميثيلي في المجموعات الفرعية للخلايا البائية السلائف بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 10 ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر معالجة الخلية بلطف شديد واستخدام الكمية المثلى من الأجسام المضادة بحيث يتم تقليل توليد الحطام الملوث باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الجيل التالي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الجينات الميثيلية والمجموعات الفرعية للخلايا البائية السليفة. لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية الحية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل تشغيل نظام تفريغ الهباء الجوي في جميع الأوقات عند تنفيذ هذا الإجراء.