تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تسمية وتصور الخلايا متعددة الهزف لأسماك الزرد في الموقع. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي مثل العوامل التي تنظم الكبريتات متعددة الهبوب في كلية الزرد الجنينية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصنيف كل من نصوص البروتين والحمض النووي الريبي في وقت واحد وهو أمر مفيد في حالة عدم وجود أجسام مضادة خاصة بأسماك الزرد.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما ذهبنا لتسمية الخلايا متعددة الهزات في الأنف أثناء تحليل وجود الأهداب بعد إجراء تغييرات على الجنين. ابدأ بتثبيت أجنة الزرد بعد 24 ساعة من الإخصاب في خمسة ملليلتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. بعد ذلك ، اغسل الأجنة مرتين في PBS باستخدام 0.1٪ Tween 20 أو PBST متبوعا بغسل واحد بخمسة ملليلتر من الميثانول بنسبة 100٪.

بعد ذلك ، احتضان الأجنة في خمسة ملليلتر من الإيثانول الطازج بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتحضير الأجنة للتهجين ، أعد ترطيب الأطفال حديثي الولادة في خمسة ملليلتر من 50٪ من الميثانول و PBST لمدة خمس دقائق متبوعة بخمس دقائق في خمسة ملليلتر من 30٪ الميثانول و PBST. اغسل الأجنة مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما خمسة ملليلتر من PBST واحتضان الأجنة في خمسة ملليلتر من محلول واحد إلى 1 ، 000 بروتيناز K و PBST لمدة دقيقتين متبوعة مباشرة بغسلتين أخريين في خمسة ملليلتر من PBST.

قم بإصلاح الأجنة في خمسة ملليلتر من 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة متبوعا بغسلتين في خمسة ملليلتر من PBST 20. لتسهيل التفاعلات بين الأجنة ومحلول التهجين ، انقل الأجنة إلى خمسة ملليلتر من PBST في أنابيب طرد مركزي دقيقة مسطحة القاع في رف طرد مركزي صغير وغسل الأجنة مرتين لمدة خمس دقائق لكل منها 1.5 مل من محلول التهجين. بعد الغسيل الثاني ، احتضان الأجنة في 1.5 مل من محلول التهجين الطازج عند 70 درجة مئوية في فرن تهجين لمدة أربع إلى ست ساعات.

بعد ذلك ، استبدل محلول التهجين ب 10 ميكرولتر من مسبار الحمض النووي الريبي ذي الأهمية و 500 ميكرولتر من محلول التهجين لتهجين المسبار الليلي عند 70 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، اغسل الأجنة مرتين في 1.5 مل من 50٪ فورماميد و 2X محلول سيلين الصوديوم أو SSC لمدة 20 إلى 30 دقيقة لكل غسلة عند 70 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل الأجنة مرة واحدة في 1.5 مل من 2X SSC وحده عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة متبوعا بغسلتين في 1.5 مل من 0.2X SSC عند 70 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة لكل غسلة.

بعد الغسيل الثاني ، استبدل 0.2X SSC ب 1.5 مل من الكاشف المانع لحضانة ليلية عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، استبدل الكاشف المانع ب 0.2 مل من الديجوكسين المضاد في بيروكسيداز الفجل الحار وكاشف الحجب بنسبة واحد إلى 1 ، 000 لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بعد ذلك ، اغسل الأجنة مرتين إلى أربع مرات في 1.5 مل من محلول حمض الماليك لمدة 10 إلى 15 دقيقة لكل غسلة متبوعا بحضانة ليلية عند أربع درجات مئوية في 1.5 مل من محلول حمض الماليك الطازج.

في صباح اليوم التالي ، استبدل المخزن المؤقت لحمض الماليك ب 1.5 مل من PBS واغسل الأجنة مرتين في 1.5 مل من PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. احتضان الأجنة في 0.2 مل من محلول الفلورسنت Si3 الدائم لمدة 60 دقيقة متبوعا بأربع غسلات متتالية لمدة 10 دقائق في 1.5 مل من تركيزات الميثانول الصاعدة. بعد الحضانة الأخيرة ، احتضان الأجنة في درجة حرارة الغرفة في 1.5 مل من 1٪ بيروكسيد الهيدروجين والميثانول لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الأجنة لمدة 10 دقائق لكل غسلة في 1.5 مل من محاليل الميثانول الهابطة متبوعة بغسلتين لمدة خمس دقائق في 1.5 مل من PBS. بعد ذلك ، اغسل الأجنة في 1.5 مل من الماء المقطر المزدوج لمدة خمس دقائق متبوعا بغسل لمدة سبع دقائق في 1.5 مل من الأسيتون 20 درجة مئوية تحت الصفر. اغسل الأجنة في 1.5 مل أخرى من الماء المقطر المزدوج لمدة خمس دقائق متبوعا بغسل لمدة خمس دقائق في 1.5 مل من PBST مع 1٪ DMSO أو PBDT.

احتضان الأجنة في درجة حرارة الغرفة في 1.5 مل من PBDT مع 10٪ FBS على الروك لمدة ساعتين. بعد ذلك ، استبدل PBDT و FBS ب 1.5 مل من الأجسام المضادة الأولية للحضانة الليلية عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، اغسل الأجنة في 1.5 مل من PBDT و FBS و 0.1 مولي كلوريد الصوديوم لمدة دقيقة واحدة مع التأرجح متبوعا بخمس غسلات هزاز لمدة 30 دقيقة في 1.5 مل من PBDT و FBS وكلوريد الصوديوم.

بعد الغسيل الأخير ، اغسل الأجنة مرة واحدة في 1.5 مل من PBDT و FBS لمدة 30 دقيقة فقط مع التأرجح متبوعا بحضانة ليلية في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي ، اغسل الأجنة بسرعة مرتين في 1.5 مل من PBDT متبوعا بحضانة لمدة 15 دقيقة في 1.5 مل من DAPI على هزاز. بعد ذلك ، اغسل الأجنة ثلاث مرات في 1.5 مل من PBDT باستخدام FBS وكلوريد الصوديوم لمدة 15 إلى 20 دقيقة لكل غسلة وقم بتخزين الأجنة في 1.5 مل من PBDT عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء المحيط.

لتصوير كلى الزرد ، ضع الأجنة بشكل جانبي على شرائح زجاجية في حوالي 10 ميكرولتر من PBDT. باستخدام زوج من الملقط الدقيق ومجهر تشريح ، اضغط على الجنين الأول خلف العينين لإزالة الرأس وبعض كرة الصفار. ثم اكشط كرة الصفار المتبقية برفق من جسم الجنين.

أثناء إزالة كرة صفار البيض ، احرص على عدم لمس امتداد كيس الصفار لأن الأنسجة ذات الأهمية تمزق بسهولة وتقع مباشرة فوق الامتداد. استخدم منديلا رقيقا لإزالة صفار البيض المنفصل والسائل الزائد من الشريحة. ثم أضف قطرة من وسط التثبيت إلى الذيل المتبقي وضع الذيل بشكل جانبي.

قم بتسطيح الذيل بقلة غطاء وضع الشريحة في صندوق منزلق مغطى. بعد ذلك ، استخدم هدف 60X على مجهر متحد البؤر لتصوير أهداب الكلى على قنوات الفلورسنت المناسبة. في الصور التمثيلية التالية لجنين الزرد الملون كما هو موضح للتو ، يمكن تحديد الخلايا متعددة الهزات بناء على تصور مسبار الريبوبروب المضاد للمعنى المستخدم للتعرف على تعبير نسخة ODF3B ، وتوبولين الأمشاج المسمى الأجسام القاعدية وأسداب ألفا توبولين

في الواقع ، عند هذا التكبير من الكني الجنيني ، يمكن ملاحظة خلية متعددة الهزات مع ODF3B ، يمكن ملاحظة العديد من الأجسام القاعدية والأهداب. يمكن تمييز الخلية الأحادية المجاورة بجسمها القاعدي الفردي والنمط الظاهري للأهداب المفردة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام أجنة مثبتة حديثا والحفاظ على العينات محمية من الضوء المحيط بعد إضافة الجسم المضاد الأول.