تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وسم وتصوير الخلايا متعددة الأهداب في سمكة الزيبرا في موضعها الأصلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الأحياء النمائي، مثل ما هي العوامل التي تنظم الكبريتات متعددة الأهداب في كلية جنين سمكة الزيبرا؟ وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية وسم كل من البروتين ونواتج نسخ RNA في آن واحد، وهو أمر مفيد في حالة عدم توفر أجسام مضادة متخصصة لسمكة الزيبرا.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا وسم الخلايا متعددة الهديبات في الكلية البدائية أثناء تحليل وجود الأهداب بعد إجراء تغييرات على الجنين. ابدأ بتثبيت أجنة سمك الزيبرا بعد 24 ساعة من الإخصاب في خمسة ملليلتر من 4%paraformaldehyde لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة دون تحريك. بعد ذلك، اغسل الأجنة مرتين في PBS يحتوي على 0.1%Tween 20 أو PBST، يلي ذلك غسلة واحدة بخمسة ملليلتر من 100%methanol.

بعد ذلك، يتم تحضين الأجنة في 5 mL من الإيثانول الطازج بتركيز 100% لمدة 20 دقيقة على الأقل عند درجة حرارة -20 °C. ولتجهيز الأجنة لعملية التهجين، يتم إعادة ترطيب المواليد في 5 mL من الميثانول بتركيز 50% ومحلول PBST لمدة خمس دقائق، تليها خمس دقائق في 5 mL من الميثانول بتركيز 30% ومحلول PBST. تُغسل الأجنة مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام 5 mL من محلول PBST، ثم تُحضن الأجنة في 5 mL من محلول proteinase K ومحلول PBST بنسبة تخفيف 1:1,000 لمدة دقيقتين، ويتبع ذلك مباشرة غسلتان إضافيتان في 5 mL من محلول PBST.

ثبّت الأجنة في 5 milliliters من 4%paraformaldehyde لمدة لا تقل عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسلها مرتين في 5 milliliters من PBST 20. ولتسهيل التفاعلات بين الأجنة ومحلول التهجين، انقل الأجنة إلى 5 milliliters من PBST في أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات قاع مسطح بوضع عمودي في حامل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة، واغسل الأجنة مرتين لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام 1.5 milliliters من محلول التهجين. وبعد الغسلة الثانية، حضّن الأجنة في 1.5 milliliters من محلول تهجين جديد عند 70 degrees Celsius في فرن تهجين لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات.

بعد ذلك، استبدل محلول التهجين بـ 10 µL من مسبار RNA المستهدف و 500 µL من محلول التهجين لإجراء تهجين المسبار طوال الليل عند 70 °C. وفي الصباح التالي، اغسل الأجنة مرتين في 1.5 mL من 50% formamide ومحلول saline-sodium citrate buffer أو SSC بتركيز 2X لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة لكل غسلة عند 70 °C. ثم اغسل الأجنة مرة واحدة في 1.5 mL من 2X SSC بمفرده عند 70 °C لمدة 15 دقيقة، تليها غسلتان في 1.5 mL من 0.2X SSC عند 70 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة لكل غسلة.

بعد الغسلة الثانية، استبدل محلول 0.2X SSC بـ 1.5 ملليلتر من كاشف الحجب للتحضين طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وفي صباح اليوم التالي، استبدل كاشف الحجب بـ 0.2 ملليلتر من مضاد الديجوكسين المرتبط ببيروكسيداز الفجل الحار وكاشف الحجب بنسبة 1:1,000 للتحضين لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. بعد ذلك، اغسل الأجنة من مرتين إلى أربع مرات في 1.5 ملليلتر من محلول حمض الماليك المنظم لمدة تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة لكل غسلة، يليه تحضين طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية في 1.5 ملليلتر من محلول حمض الماليك المنظم الطازج.

في صباح اليوم التالي، استبدل محلول حمض الماليك المنظم بـ 1.5 milliliters من PBS واغسل الأجنة مرتين في 1.5 milliliters من PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. قم بتحضين الأجنة في 0.2 milliliters من محلول Si3 الفلوري لمدة 60 دقيقة، تليها أربع غسلات متتالية لمدة 10 دقائق في 1.5 milliliters من تركيزات متصاعدة من الميثانول. بعد التحضين الأخير، حضن الأجنة في درجة حرارة الغرفة في 1.5 milliliters من 1% hydrogen peroxide والميثانول لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، تُغسل الأجنة لمدة 10 دقائق لكل غسلة في محاليل ميثانول تنازلية بحجم 1.5 milliliters، تليها غسلتان لمدة خمس دقائق في 1.5 milliliters من PBS. بعد ذلك، تُغسل الأجنة في 1.5 milliliters من الماء المقطر مرتين لمدة خمس دقائق، تليها غسلة لمدة سبع دقائق في 1.5 milliliters من الأسيتون عند درجة حرارة -20 °C. تُغسل الأجنة في 1.5 milliliters أخرى من الماء المقطر مرتين لمدة خمس دقائق، تليها غسلة لمدة خمس دقائق في 1.5 milliliters من PBST مع 1% DMSO أو PBDT.

يتم تحضين الأجنة في درجة حرارة الغرفة في 1.5 milliliters من PBDT مع 10%FBS على جهاز هزاز لمدة ساعتين. بعد ذلك، يُستبدل PBDT وFBS بـ 1.5 milliliters من الأجسام المضادة الأولية للتحضين طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. وفي الصباح التالي، تُغسل الأجنة في 1.5 milliliters من PBDT وFBS و0.1 molar من كلوريد الصوديوم لمدة دقيقة واحدة مع الهز، يليه خمس غسلات بالهز لمدة 30 دقيقة لكل منها في 1.5 milliliters من PBDT وFBS وكلوريد الصوديوم.

بعد الغسلة الأخيرة، تُغسل الأجنة مرة واحدة في 1.5 milliliters من PBDT و FBS لمدة 30 دقيقة فقط مع التحريك المستمر، يليه تحضين طوال الليل في 200 microliters من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius مع الحماية من الضوء. وفي صباح اليوم التالي، تُغسل الأجنة سريعاً مرتين في 1.5 milliliters من PBDT، يليه تحضين لمدة 15 دقيقة في 1.5 milliliters من DAPI على جهاز التحريك. بعد ذلك، تُغسل الأجنة ثلاث مرات في 1.5 milliliters من PBDT مع FBS وكلوريد الصوديوم لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة لكل غسلة، ثم تُحفظ الأجنة في 1.5 milliliters من PBDT عند درجة حرارة أربع درجات Celsius مع الحماية من الضوء المحيط.

لتصوير كلى سمكة الزيبرا، ضع الأجنة بشكل جانبي على شرائح زجاجية في حوالي 10 microliters من PBDT. وباستخدام ملقط دقيق ومجهر تشريحي، اضغط على الجنين الأول خلف العينين لإزالة الرأس وجزء من كيس المح. بعد ذلك، اكشط برفق ما تبقى من كيس المح من جسم الجنين.

أثناء إزالة كرة المح، توخَّ الحذر لعدم لمس امتداد كيس المح، حيث إن النسيج المستهدف يتمزق بسهولة ويقع مباشرة فوق هذا الامتداد. استخدم منديلاً رقيقاً لإزالة المح المتفكك والسائل الزائد من الشريحة. بعد ذلك، أضف قطرة من وسط التثبيت إلى الذيل المتبقي وضع الذيل بشكل جانبي.

قم بتسطيح الذيل باستخدام شريحة غطاء وضع الشريحة في صندوق شرائح مغلق. بعد ذلك، استخدم العدسة الشيئية 60X في مجهر بؤري (confocal microscope) لتصوير أهداب الكلى عبر القنوات الفلورية المناسبة. في الصور التمثيلية التالية لجنين سمكة الزيبرفيش المصبوغ كما تم توضيحه للتو، يمكن تحديد الخلايا متعددة الأهداب بناءً على رؤية مسبار الريبونوكلييك المضاد (antisense riboprobe) المستخدم للتعرف على تعبير نسخ ODF3B، والأجسام القاعدية المحددة ببروتين tubulin الأمشاج، والأهداب المحددة ببروتين alpha tubulin المُستيل.

بالفعل، عند هذا التكبير للكلى الأمامية الجنينية، يمكن ملاحظة خلية متعددة الأهداب تحتوي على نسخ من ODF3B، وأجسام قاعدية وأهداب متعددة. ويمكن تمييز الخلية أحادية الهدب المجاورة من خلال نمطها الظاهري المتمثل في جسم قاعدي واحد وهدب واحد. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام أجنة مثبتة حديثاً والحفاظ على العينات محمية من الضوء المحيط بعد إضافة الجسم المضاد الأول.