التحديد الكمي للتهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي من الأفراد ذوي الأمراض المزمنة التحريضية

الهدف العام من هذا الاختبار هو تحديد قدرة الخلايا الوحيدة من العينات السريرية البشرية على الخضوع للهجرة عبر البطانة وتكوين الخلايا الرغوية. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال القلب والأوعية الدموية مثل إمكانات تصلب الشرايين للخلايا من الأفراد المعرضين لخطر الإصابة بمرض الشريان التاجي الحاد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن قياس العينات السريرية من الدم الكامل الطازج أو مجموعات المرضى المخزنة.

علاوة على ذلك ، يمكن قياس تكوين الخلايا الرغوية عن طريق كل من الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. أولا ، قم بإعداد المواد الهلامية المبلمرة من معلق الكولاجين الطازج. إلى أنبوب البوليسترين سعة خمسة ملليلتر ، أضف هيدروكسيد الصوديوم ، ثم 10 مرات M199 ، ثم الحمض الحمضي ، وأخيرا أضف الكولاجين الليفي.

امزج هذا جيدا عن طريق سحب العينات. بعد ذلك ، قم بوضع 50 ميكرولترا في الآبار الداخلية للوحة زراعة الأنسجة المعقمة ذات القاع المسطح 96 بئر. في الحواف الخارجية للآبار ، قم بتحميل 200 ميكرولتر من Dulbecco PBS مرة واحدة لمنع الجفاف.

بعد ساعتين من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، سوف يتبلمر الكولاجين. بعد ذلك ، قم بتراكب المواد الهلامية ب 150 ميكرولتر من M199 المكمل مرة واحدة واحتضانها حتى الحاجة إليها للاستخدام بعد خمسة أيام. لتوسيع الخلايا البطانية للوريد السري البشري المخزنة ، قم بإعداد قارورة استزراع مساحتها 25 سم مربع مع مليلتر واحد من محلول الفيبرونيكتين واحتضان الطبق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في هذه الأثناء ، قم بإذابة الخلايا المخزنة في حمام مائي لإعادة تعليقها في M20. بمجرد إذابة الخلايا ، استنشق أي محلول فيبرونيكتين متبقي من الطبق وقم بوضع الخلايا. ثم, الثقافة إلى التقاء عن طريق استبدال وسائل الإعلام بعد يومين إلى ثلاثة أيام.

يجب أن تكون HUVECs ملتقية في اليوم الخامس من الزراعة. افصلها عن طريق شفط المادة الطافية للثقافة من القارورة ، ثم اغسل الوسائط المحتوية على المصل باستخدام ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من مرة واحدة في PBS. ثم أضف خمسة ملليلتر من التربسين المخفف واحتضن الخلايا لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة مع هز الخلايا برفق حتى تبدو منفصلة.

بعد ذلك ، قم بجمعها بسرعة بخمسة ملليلتر من M20 وانقل التعليق إلى أنبوب سعة 10 ملليلتر وخلايا طرد مركزي. الآن ، أعد تعليق الخلايا في M20 عند 200 ، 000 خلية لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بشفط M199 من لوحة الكولاجين المحضرة وأضف 100 ميكرولتر من HUVECs إلى كل جل.

استمر في الثقافة لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الثامن من زراعة HUVECs ، قم بتنشيط الطبقات الأحادية قبل إضافة الخلايا الوحيدة. بعد شفط وسائط التراكب ، أضف 100 ميكرولتر من محلول TNF-alpha البشري إلى كل بئر.

ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط واغسل المواد الهلامية مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من M199 لكل غسلة. الآن ، أضف 50،000 من الخلايا الوحيدة المعزولة حديثا أو مجموعات فرعية أحادية الخلية المنقاة في 100 ميكرولتر من M20 إلى الطبقات الأحادية HUVEC.

بعد إضافة الخلايا الوحيدة ، احتضن اللوحة لمدة ساعة للسماح بالانتقال الأمامي للخلايا. بعد ساعة ، اجمع الخلايا غير المنقولة في محلول الغسيل. ابدأ بتجميع غسلتين EGTA باستخدام 100 ميكرولتر لكل بئر.

بعد ذلك ، قم بتدوير محاليل الغسيل المدمجة عند 300 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 30 ميكرولترا من PBS وعد الخلايا لتحديد النسبة المئوية للخلايا المنقولة إلى الأمام. الآن ، اغسل آبار الألواح مرة واحدة باستخدام M199 وأضف 100 ميكرولتر من M20 الطازج إلى آبار الألواح واحتضان اللوحة لمدة يومين.

بعد يومين ، كرر إجراء جمع الخلايا غير المنقولة في محلول غسيل EGTA من أجل جمع الخلايا المنقولة العكسية والمضي قدما في تحليل النمط الظاهري للخلايا. لتوصيف الخلايا المرتبطة بالهلام ظاهريا عن طريق تحليل FACS ، قم بهضم الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من الكولاجين D بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، نقع المواد الهلامية باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر واحتضانها لمدة 20 دقيقة أخرى لهضم المواد الهلامية بالكامل.

بمجرد هضمها بالكامل ، قم بتصفية وتجميع المواد الهلامية المكررة المهضومة من خلال شبكة نايلون 35 ميكرون في أنبوب FACS على الجليد. الآن ، اغسل الخلايا المفلترة مرة واحدة بمحلول غسيل FACS البارد. الطرد المركزي للخلايا وتعليقها في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.

بعد ذلك ، قم بإجراء تلطيخ وتحليل FACS وفقا لبروتوكول النص. لتحليل الخلايا عن طريق الفحص المجهري ، قم أولا بتلطيخ الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. لفصل الخلايا الملطخة ، قم بلف الآبار باستخدام إبرة قياس 21 بحيث يكون الشطبة متجها للخارج.

بعد ذلك ، قم بإعداد الشرائح لتركيب المواد الهلامية. قم بعمل فتحتين صغيرتين في شريط من الشريط على الوجهين ثم قم بتثبيت الشريط على الشريحة وقم بإزالة الطلاء الواقي. بعد ذلك ، أضف قطرة ماء إلى كل ثقب في الشريط.

ثم ، باستخدام الملقط ، انقل برفق اثنين من المواد الهلامية على الفتحتين وقم بتغطية الشريط. أخيرا ، قم بإرفاق غطاء بعناية بالشريط واستمر في تصور الخلايا. بعد التهجير ، تم حساب الخلايا غير المنقولة كما هو موصوف.

تم استرداد ما مجموعه 15,000 خلية غير منقولة ، وتم تحديد النسبة المئوية للانتقال إلى الأمام لتكون 95٪ بعد 48 ساعة من الحضانة الإضافية ، تم استرداد 36,000 خلية منقولة عكسية بلغت 12.6٪ من الخلية العكسية. كشف تلطيخ المواد الهلامية بالزيت الأحمر O عن خلايا الرغوة التي يشار إليها الأسهم البيضاء والبلاعم المشار إليها بسهام سوداء. تمت معالجة هذه الخلايا الوحيدة باستخدام LDL المؤكسد أثناء التهجير ، وهي مادة تستخدم للحث على تكوين خلايا الرغوة في نماذج تحريض الخلايا الرغوية التقليدية.

أكدت بيانات عدد الخلايا المجمعة من 12 متبرعا أن حضانة الخلايا الوحيدة مع LDL المؤكسد تسبب في تكوين خلايا رغوية أكثر مما كانت عليه عندما يتم تحضين الخلايا الوحيدة بوسائط LDL أو M199 الأصلية وحدها. تم تحليل الخلايا المنقولة أيضا عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد استبعاد الخلايا الميتة والمزدوجات و CD45 HUVECs السلبية ، تم اختيار السكان الرئيسيين للخلايا المهاجرة وتمت مقارنة متوسط شدة التألق للمستقبلات ذات الأهمية مع التألق ناقص واحد أو بيانات التحكم في النمط المتماثل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام هذا الاختبار لتحديد هجرة الخلايا الأحادية عبر البطانة وتكوين الخلايا الرغوية من العينات السريرية البشرية. لا تنس أن العمل مع العينات السريرية البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما استخدام تقنية معملية جيدة.