بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إجراء اختبار دقيق لعينات نخاع العظام من مرضى ابيضاض الدم النخاعي الحاد بحثا عن الأمراض المتبقية القابلة للقياس بما في ذلك القياس الكمي للخلايا الجذعية لسرطان الدم. يمكن أن توفر هذه الطريقة تقييما دقيقا للمرض المتبقي القابل للقياس في عينات نخاع العظام لمرضى سرطان الدم النخاعي الحاد. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أن المتابعة الدقيقة للبروتوكول تؤدي إلى نتائج عالية التكرار وعالية الجودة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى اتخاذ القرارات السريرية حيث يمكن استخدامها كقراءة لاستجابة المرضى للعلاج. سيوضح الإجراءات جيروين يانسن ، أخصائي أمراض الدم ، وجيريت سيجم ، فني مختبر أمراض الدم التشخيصي وجنيفر شيك وساندر سنيل ، فنيي فريق MRD. مع وجود المريض في وضع الاستلقاء الجانبي ، قم بتمييز العمود الفقري الحرقفي الخلفي العلوي بقلم وتطهير جلد منطقة الخزعة المقصودة ب 0.5 إلى 1٪ كلورهيكسيدين في الإيثانول بحركة دائرية خارجية.

بعد إعطاء مخدر موضعي ، التقط إبرة قياس 15 بوصة مقاس 2.8 بوصة مع الطرف القريب في راحة اليد والسبابة على جانب العمود المعدني للإبرة بالقرب من الطرف للتحكم. باستخدام ضغط لطيف ولكن ثابت ، أدخل الإبرة بحركة متناوبة سريعة من خلال الجلد المخدر باتجاه العمود الفقري الحرقفي. عندما تتلامس الإبرة مع العمود الفقري الحرقفي الخلفي ، قم بإزالة الغطاء وقم بتوصيل حقنة فارغة سعة 10 ملليلتر بالإبرة.

اسحب المكبس برفق لخلق ضغط سلبي داخل المحقنة حتى يتم حصاد ما يصل إلى 10 ملليلتر من شويكات نخاع العظم. لا تأخذ أكثر من 10 مل من نخاع العظم لكل شفط لتجنب تخفيف الدم. قم بإزالة المحقنة ووضع الغطاء مرة أخرى على الإبرة.

بعد ذلك ، قم بإخراج حوالي ملليلترين من النخاع في زجاج الساعة وتأكد من سحب عينة كافية ليتم حقنها في أنبوب سعة ثمانية ملليلتر مطلي بالهيبارين وعكس الأنبوب على الفور. لمنع التخثر ، من المهم استثمار الأنبوب المحتوي على مضادات التخثر بمجرد إضافة نخاع العظم. للحصول على التقييم المورفولوجي الأمثل ، استخدم ملعقة بلاستيكية لنقل الشوكات من الشفط في زجاج الساعة إلى شريحة زجاجية ، وقم بتمرير شريحة زجاجية أخرى بعناية فوق النخاع.

بعد التجفيف ، قم بتلطيخ الشوكات باستخدام May-Grunwald Giemsa لتحليلها بواسطة المجهر الضوئي. ضع أنبوب نخاع العظم في حامل بلاستيكي وضع الحامل في وعاء بلاستيكي به عبوة هلام محيطة ونموذج طلب مكتمل. قبل تحليل نخاع العظم عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ابدأ تشغيل مقياس التدفق الخلوي وافتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي لإنشاء تجربة جديدة باستخدام مخطط مبعثر أمامي مقابل مخطط نقطة مبعثر جانبي.

لتقييم حجم الخلايا وحبيبتها ، قم بتحميل خلايا الدم المحيطية المحللة غير المسماة من متبرع سليم وحدد وظيفة اكتساب الخلايا. قم ببوابة الخلايا الليمفاوية واضبط الفولتية المشتتة الأمامية والجانبية للوصول إلى متوسط القيم المستهدفة المناسبة لمجموعة الخلايا المسورة. بعد ذلك ، احصل على بيانات لما لا يقل عن 10,000 حدث.

لإعداد الفولتية الأنبوبية المضاعفة للصور لقناة الإزهار المستهدفة ، استخدم أولا جزيئات معايرة حبة قوس قزح ذات الثماني ذروة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للحصول على 10 ، 000 حدث بمعدل تدفق منخفض. قم ببوابة الخرز المفرد في مخطط النقاط المبعثرة الأمامية مقابل الجانب متبوعا ببوابة الذروة السابعة في مخطط نقطة FITC-PE. قم ببوابة مجموعات الخرزة الناتجة لكل فلوروفور.

استمر في الحصول على تعليق حبة قوس قزح ذو الثماني ذروة وضبط وضبط جهد PMT في جميع قنوات التألق للوصول إلى قيم MFI المستهدفة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم السجل لجمع بيانات حوالي 2,000 حدث والتحقق من مؤسسة التمويل الأصغر للحصول على حبات الذروة السابعة. بعد ذلك ، أضف حجما كافيا من كل جسم مضاد مترافق تجريبي من الدقيق لتلطيخ الخرزات في أنابيب الإزهار المقابلة مطروحا منها عنصر تحكم واحد ودوامة الأنابيب جيدا.

قم بإنشاء تجربة فارغة جديدة بنفس معلمات التعويض مع الحرص على تعيين عتبة التشتت الأمامية على 5 ، 000 وقيم التعويض لجميع الفلوروكرومات هي صفر. لإنشاء عناصر التحكم في التعويض، حدد وظيفة إنشاء التحكم في التعويض وقم بتحميل أنبوب التحكم غير الملوث. اضبط البوابة P1 حول مجموعة الخرزة المفردة وتأكد من أن بوابة P1 تحتوي على خرز مفرد فقط.

بزر الماوس الأيمن فوق بوابة P1 وحدد تطبيق على جميع عناصر التحكم في التعويض. بعد ذلك ، سجل البيانات لجميع أنابيب الإزهار المفردة التي تؤكد أن بوابة P2 تشمل السكان الإيجابيين في كل رسم بياني للنور. لتلطيخ الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي ، انقل نخاع العظم إلى المختبر ، وتحقق من نموذج الطلب للتحقق من رقم دراسة المريض وتاريخ ميلاده وتحديد ما يجب تلطيخه.

بالنسبة للMRD ، نستخدم لوحة تلطيخ تتكون من أربعة أنابيب. نوضح هنا تلطيخ لوحة LSC التي تتكون من أنبوب واحد. بعد تعداد الخلايا ، انقل الحجم المناسب من نخاع العظم إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا.

أضف المخزن المؤقت للتحلل بمعدل 10 أضعاف حجم الخلية التجريبية لتحلل خلايا الدم الحمراء. اقلب الأنبوب لخلط الخلايا واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة التحلل ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الخلايا في 15 مل من محلول الغسيل في درجة حرارة الغرفة وحصاد حبيبات الخلية مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. في غضون ذلك ، قم بسحب الكمية المناسبة من محلول كوكتيل الأجسام المضادة في أنابيب FACS سعة خمسة ملليلتر. تظهر هنا لوحة أنبوب الخلايا الجذعية.

أعد تعليق الحبيبات في مخزن الغسيل المؤقت وأضف تعليق الخلية إلى أنبوب FACS الذي يحتوي على محلول كوكتيل الأجسام المضادة أحادية النسيلة لمدة 15 دقيقة في الظلام. ثم اغسل الخلايا في مخزن الغسيل وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من محلول الغسيل الطازج.

لتحليل الخلايا الجذعية لسرطان الدم ، أضف أربعة ميكرولترات من الخرز الفارغ إلى معلق الخلية الملطخ بكوكتيل الأجسام المضادة للخلايا الجذعية. بعد ذلك ، اقرأ العينات باستخدام المعلمات المحددة مسبقا للحصول على ما لا يقل عن أربعة أضعاف 10 إلى 6 الأحداث من عينات المريض التجريبية. لتحديد النمط المناعي المرتبط بسرطان الدم الذي لوحظ في ما يقرب من 90٪ من مرضى سرطان الدم النخاعي الحاد ، من الأهمية بمكان أن يتم ضبط بوابات الانفجار بشكل مناسب كما هو موضح.

هنا ، يتم عرض أمثلة على البيانات من المرضى الفرديين الذين يؤوون أنواعا مختلفة من الشذوذ على الخلايا البدائية الإيجابية CD34. في هذه الرسوم البيانية ، يمكن ملاحظة المريض الذي لا يزال في مغفرة كاملة والمريض الذي انتكس بعد الحصول على نتائج إيجابية للمرض المتبقي القابلة للقياس بعد الدورة الثانية من العلاج التعريفي مما يؤكد الحاجة إلى إعداد البوابة بدقة قبل تحليل العينة. يتطلب تحديد LSC وقياسه تحليلا إضافيا للانفراخات على وجه التحديد على الخلايا الانفجارية السلبية CD38 الإيجابية CD34 كما هو موضح في هذه الرسوم البيانية.

أثناء تنفيذ هذا البروتوكول ، من المهم جدا أن يكون لديك موظفون متخصصون واحتياطيون لأخذ عينات نخاع العظام والنقل والعمل التجريبي وخطوات التحليل لهذا الإجراء. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لإجراء التحليل الوراثي الخلوي والجزيئي للإجابة على أسئلة إضافية حول العلاقة بين مجموعات خلايا معينة والانحرافات الجزيئية ذات الأهمية ، أو لتحسين مجموعة المخاطر للمريض للتنبؤ بالنتائج السريرية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الدم لاستكشاف المرض المتبقي لدى مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد بعد العلاج.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد وقياس المرض المتبقي بدقة باستخدام قياس التدفق الخلوي بما في ذلك جمع ونقل عينات نخاع العظام لمرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد.