توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف السكريات في جدار الخلية النباتية. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا جدار الخلية النباتية بما في ذلك بنية الجلوكومانان وكميتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب تدريبا متخصصا أو معدات باهظة الثمن.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من أجل تفسير المواد الهلامية ، لذا فإن إدراج وفهم جميع الضوابط الموصوفة أمر بالغ الأهمية. يتم تحضير الكحول والمخلفات القابلة للذوبان مسبقا ، أو AIR ، من المواد النباتية المحصودة كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بوزن ستة ملليغرامات من AIR في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر وأضف الماء إلى التركيز النهائي البالغ ملليغرامين لكل ملليلتر.

دوامة لتحقيق تعليق متساو. Aliquot 500 ميكروغرام في أنابيب الطرد الدقيق. تجفيف الحصص باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

قم بمعالجة AIR مسبقا بما في ذلك حصة للتحكم في الهواء بدون إنزيم باستخدام هيدروكسيد الصوديوم المولي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، أضف 200 ميكرولتر من الماء و 20 ميكرولترا من حمض الهيدروكلوريك المولي إلى كل أنبوب لتحييد هيدروكسيد الصوديوم. اختبر أن الرقم الهيدروجيني يتراوح بين ستة إلى سبعة عن طريق إزالة ميكرولتر واحد واكتشافه على شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني الورقية.

أضف 50 ميكرولترا من الرقم الهيدروجيني 6.0 لأسيتات الأمونيوم المولارية ، وأضف الماء إلى الحجم الإجمالي البالغ 500 ميكرولتر لكل أنبوب. لبدء هذا الإجراء ، أضف كمية محددة مسبقا من المانانات إلى حصص AIR والمخزن المؤقت. قم بتضمين الضوابط السلبية المناسبة بالإضافة إلى التحكم الإيجابي.

دوامة ثم تدور لفترة وجيزة لجمع خليط التفاعل في قاع الأنبوب. احتضن عند 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، أوقف التفاعل عن طريق الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق. احفظ المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 250 ميكرولتر من الماء. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى والاحتفاظ بالمادة الطافية.

امزج كل من المواد الطافية وجففها في جهاز طرد مركزي مفرغ على حرارة 30 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تقريبا. قبل إجراء الاشتقاق ، قم بإعداد الكواشف اللازمة كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتسخين محلول المرق 0.2 مولار إلى 60 درجة مئوية لإذابة المادة الصلبة تماما.

أضف إلى كل عينة خمسة ميكرولترات من ANTS وخمسة ميكرولترات من اثنين من البيكولين والبوران و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاشتقاق. تدور لفترة وجيزة لتتجمع في الجزء السفلي من الأنبوب ، ثم دوامة جيدا ثم تدور لفترة وجيزة مرة أخرى. احتضان العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء.

في اليوم التالي ، جفف العينات في جهاز طرد مركزي مفرغ عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين تقريبا. أعد تعليق كل عينة في معيار قليل السكاريد و 100 ميكرولتر من ثلاثة يوريا مولية. يحفظ في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر محمي من الضوء لحين الحاجة.

يعتمد تجميع معدات صب الجل على العلامة التجارية. بالنسبة للمعدات المستخدمة في هذا العرض التوضيحي ، فإن مادة هلامية واحدة تعادل 50 ملليلترا. في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر ، امزج 20.2 مل من الماء ، وخمسة ملليلتر من 10x PACE buffer ، و 24.6 مل من 40٪ أكريلاميد / بيس أكريلاميد ، و 200 ميكرولتر من APS و 20 ميكرولتر من TEMED.

اقلبها برفق للخلط مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء. استخدم ماصة مصلية أو غيرها من الماصات كبيرة الحجم لصب هلام المحلول على عمق أربعة سنتيمترات تقريبا أسفل الجزء العلوي من الألواح الزجاجية. تراكب الجل بعناية مع كحول الأيزوبروبيل.

اترك الجل يتبلمر لمدة 20 إلى 30 دقيقة. اسكب الطبقة العليا. جفف أي سائل زائد باستخدام ورق النشاف.

بعد ذلك ، اصنع جل التراص. في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر ، امزج 6.8 مل من الماء ، ومليلتر واحد من 10x PACE المؤقت ، و 2.8 مل من مادة الأكريلاميد / Bis-acrylamide ، و 80 ميكرولتر من APS وثمانية ميكرولتر من TEMED. اقلبها للخلط ، وتراكبها فوق جل الحل المبلمر.

أدخل المشط برفق لتجنب حبس فقاعات الهواء تحت أسنان المشط. بعد بلمرة الجل ، لفه في منديل مبلل ثم في غلاف بلاستيكي ، وقم بتخزينه على حرارة أربع درجات مئوية لحين الحاجة. للمساعدة في تتبع ترتيب التحميل وتحديد مكان الآبار بمجرد إزالة المشط ، استخدم علامة دائمة لتسمية مواضع البئر على الزجاج.

قم بإزالة المشط. املأ الآبار بمخزن مؤقت واحد X PACE. استخدم حقنة دقيقة سعة 10 ميكرولتر لتحميل ميكرولترين من المعايير والعينات في الآبار.

تجنب استخدام الممرات الخارجية التي تميل إلى تشغيل العينات بشكل سيئ وترك حارة فارغة بين العينات. قم بتجميع الحجرة العلوية لجهاز تشغيل الهلام وضع الجل في خزان تشغيل مبرد يحتوي على عازلة PACE واحدة-X. املأ الغرفة العلوية بمخزن مؤقت واحد X PACE.

قم بتشغيل الطاقة وتشغيل الجل عند 200 فولت لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بزيادة الجهد إلى 1 ، 000 فولت لمدة ساعة و 40 دقيقة. حماية الجل من الضوء.

ابدأ بمسح نظام تصوير الجل بمنديل رطب خال من النسالة للتأكد من خلوه من الغبار. قم بإزالة الجل من خزان PACE واعرضه لفترة وجيزة بينما لا يزال الجل في الألواح الزجاجية لتحديد ما إذا كانت مقدمة الصبغة لا تزال على الجل. استخدم أداة إسفين لفتح الجل وبينما لا يزال الجل على طبق زجاجي واحد ، استخدم قطاعة بيتزا لإزالة كل من جل التكديس والجزء السفلي من الجل إذا كانت مقدمة الصبغة لا تزال على الجل.

قم بتوزيع حوالي خمسة ملليلتر من الماء على سطح جهاز المصباح ثم انقل الجل مباشرة إلى جهاز المصباح المضيء. باستخدام البرنامج ، اضبط الفلتر على الأشعة فوق البنفسجية 605 وقم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الموجة التقط عدة صور في أوقات تعرض مختلفة مع التأكد من إطفاء ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين الصور لتجنب تدهور الفلورة.

تأكد من أن صورتين على الأقل لا تحتوي على نطاقات مشبعة. احفظ الملفات كصور TIFF عالية الدقة. يتم عرض هلام تمثيلي لمقايسة PACE القياسية لمحتوى مانان جدار الخلية.

تظهر الممرات الأولى والثانية والثالثة سلما من السكريات قليلة السكاريد المشتراة تجاريا بتركيز خمسة و 10 و 50 بيكومول على التوالي. يظهر الممر الرابع هضم ماناناز للجلوكومانان konjac والذي يعمل كتحكم إيجابي لكل من الهضم الأنزيمي وتفاعل الاشتقاق في وجود الإنزيم والأملاح العازلة. يظهر الممر الخامس بصمة PACE لجذع نبات الأرابيدوبسيس من النوع البري.

يظهر الممر السادس بصمة PACE للجذع من نبات نبات الأرابيدوبسيس الذي يفتقر إلى سينسيز المانان الجذعي الرئيسي. بالمقارنة مع النوع البري ، توجد كمية صغيرة فقط من المانان كما يتضح من شدة النطاق المنخفضة لجميع السكريات قليلة السكاريد المشتقة من الماناناز. يظهر الممر 10 بصمة PACE لخشب الصنوبر الذي يحتوي على galactoglucomannan وله نمط من السكريات قليلة السكاريد التي تم إطلاقها يختلف بوضوح عن نبات الأرابيدوبسيس.

الممر السابع والثامن والتاسع و11 عبارة عن عناصر تحكم سلبية مختلفة تكشف عن نطاقات غير محددة مميزة بعلامات نجمية يجب استبعادها من التحليل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد حقا لكيفية تحليل بنية المانان باستخدام PACE. بمجرد إتقانها ، يمكن تطبيق هذه التقنية على السكريات الأخرى ذات الأهمية باستخدام هيدرولاز جليكوزيل مختلف.

لقد نجحنا في تطبيق هذه التقنية على العديد من الأنواع النباتية الأخرى بالإضافة إلى نبات الأرابيدوبسيس وكذلك على الأنواع الأخرى غير النباتية مثل مانان الخميرة.