الجمع بين رامان التصوير وتحليل متعدد المتغيرات لتصور اللجنين، السليلوز، وهيميسيلولوز في جدار الخلية النباتية

الهدف العام من هذه التجربة هو تقديم طريقة عامة لتصور اللجنين والسليلوز والهيميسليلوز في جدار الخلية النباتية عن طريق تصوير رامان والتحليل متعدد المتغيرات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكتلة الحيوية للنبات ، مثل كيفية توزيع المكونات الكيميائية الرئيسية في جدار الخلية النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحقيق معلومات خالية من العمالة وغير مدمرة حول العينة بأقل قدر ممكن من تحضير العينة.

للبدء ، قم بقطع كتلة صغيرة من الأنسجة من عينة النبات. اغمر الأنسجة في الماء المغلي منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة. ثم انقله على الفور إلى الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

كرر هذه الخطوة حتى يغرق النسيج في قاع الحاوية ، مما يشير إلى إزالة الهواء الموجود في الأنسجة وأن الأنسجة قد تليين. قم بإعداد 20٪ 50٪ 70٪ و 90٪ من PEG والمياه منزوعة الأيونات ، بالإضافة إلى PEG النقي. حافظ على المحاليل 65 درجة مئوية.

احتضان الأنسجة في سلسلة من حمامات PEG المتدرجة لإزاحة الماء ، والسماح ل PEG بالتسلل. يجف في 20٪ PEG لمدة ساعة واحدة ، و 50٪ PEG لمدة ساعة ونصف ، و 70٪ PEG لمدة ساعتين ، و 90٪ PEG لمدة ساعتين ، و 100٪ PEG لمدة 10 ساعات. بعد ذلك ، قم بتسخين الكاسيت مسبقا على حرارة 65 درجة مئوية في الفرن.

صب كتلة الأنسجة التي تحتوي على PEG في الكاسيت ، ثم ضع كتلة الأنسجة في الموضع المطلوب باستخدام ملاقط أو إبر مسخنة مسبقا. قم بتبريد الكاسيت ببطء ، وقم بتخزين المناديل في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. قم بتشريح كتلة PEG التي تحتوي على الأنسجة المستهدفة إلى كتلة صغيرة باستخدام شفرة حلاقة حادة.

قم بتركيب كتلة PEG الصغيرة على الميكروتوم ، وقم بقطع الأجزاء الرقيقة من كتلة PEG. بعد ذلك ، اشطف الأقسام بالماء منزوع الأيونات في فئة الساعة 10 مرات لإزالة PEG من الأنسجة. بعد ذلك ، اغمر الأقسام بالتولوين والإيثانول لمدة ست ساعات لإزالة المستخلصات.

تحضير سائل التفاعل عن طريق خلط 65 مل من الماء منزوع الأيونات ، و 0.5 مل من حمض الأسيتيك ، و 0.6 جم من كلوريد الصوديوم في دورق أضف قسما واحدا و 3 مل من سائل التفاعل إلى قارورة سعة 5 مل. المسمار في الجزء العلوي من القارورة.

ثم سخني القارورة في حمام مائي على حرارة 75 درجة مئوية لمدة ساعتين لإزالة اللجنين من الأنسجة. اشطف القسم بالماء منزوع الأيونات في كوب ساعة 10 مرات. بعد ذلك ، انقل القسم غير المعالج وغير الخشبي إلى شريحة مجهر زجاجي.

افتح القسم بعناية باستخدام الفرش أو الإبر. قم بإزالة الماء الزائد منزوع الأيونات باستخدام المناديل الورقية. ثم اغمر القسم في أكسيد الديوتيريوم.

قم بتغطية العينة بقلة غطاء زجاجي. أغلق زلة الغطاء بطلاء الأظافر لمنع تبخر أكسيد الديوتيريوم. افتح برنامج تشغيل الجهاز الخاص بمجهر رامان متحد البؤر.

قم بتشغيل الليزر ، وركز على خدمة الكريستال والسيليكون بهدف مجهر 100x. انقر فوق زر المعايرة لمعايرة الجهاز. قم بتبديل الجهاز إلى وضع المجهر البصري وقم بتشغيل مصباح المجهر.

قم بتركيب شريحة المجهر على المسرح ، بحيث يكون زلة الغطاء في مواجهة الهدف. اعرض العينة بهدف المجهر 20x وحدد منطقة الاهتمام. قم بالتبديل إلى هدف المجهر الغاطس.

ضع زيت الغمر على زلة الغطاء ، ثم ركز على سطح العينة. بعد ذلك ، قم بتبديل الجهاز إلى وضع اختبار Raman وقم بإيقاف تشغيل مصباح المجهر. اختر منطقة تعيين باستخدام أداة مستطيلة.

قم بتغيير حجم الخطوة لتحديد عدد الأطياف التي تم الحصول عليها. اعلم أن حجم الخطوة يجب أن يكون أكبر من قطر البقعة ، محسوبا بالفتحة العددية للهدف. ستؤدي الأحجام الأقل من هذا إلى الإفراط في أخذ العينات.

اضبط المعلمات الطيفية المثلى للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء وجودة طيفية ، ووقت اقتناء مناسب اعتمادا على ملاءمة العينة. بشكل عام ، أدخل معلمات التصوير في برنامج الجهاز باستخدام طول موجة ليزر يبلغ 532 نانومتر ، ومرشح 100٪ ثقب 300 ، وشق 100 ، ومطياف 1840 سنتيمترا عكسيا ، وأخاديد 1200T ، وهدف زيت 60x ، ووقت اكتساب ثانيتين. احفظ البيانات الطيفية قبل معالجة البيانات ، وقم بتحويل البيانات إلى تنسيق عالمي قبل المتابعة إلى تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.

هنا أطياف رامان الأصلية لجدار خلية الحور. تنتشر إشارتان رئيسيتان للضوضاء ، بما في ذلك الانجرافات الأساسية والمسامير الكونية ، إلى القنوات جنبا إلى جنب مع الإشارات الفعلية. يجب إزالتها قبل تحليل البيانات.

يمكن تطبيق تقنية تقليل الضوضاء مثل خوارزمية Savitzky-Golay أو خوارزمية المويجة للتخلص من إشارات الضوضاء هذه. لتصوير اللجنين ، ضع في اعتبارك الذروة الطيفية حوالي 1600 سنتيمتر عكسي بسبب اهتزاز التمدد المتماثل للحلقة العطرية. لتصوير عديد السكاريد ، استخدم الذروة الطيفية حوالي 2889 سنتيمترا عكسيا بسبب امتدادات CH و CH2.

ومع ذلك ، لا يمكن إنشاء صور رامان للسليلوز والهيميسليلوز مباشرة. يعد الإلغاء إجراء ضروريا لكشف الخصائص الطيفية لها. بشكل عام ، نحن جدد على هذه الطريقة.

نحن نكافح ، لأنه يتطلب تدريبا على التعامل مع وظهور تقسيم العينات وتحليل البيانات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على معلومات كيميائية حول جدار الخلية النباتية باستخدام طرق الموقع. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المعالجة الكيميائية المسبقة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل تمرد جدار الخلية النباتية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للطبيعة الهيكلية الداخلية والكيمياء الطبوبية داخل جدار الخلية النباتية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على عينات بيولوجية أخرى.