تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

الهدف العام من هذه الطريقة هو توضيح كيف يمكن تصور مصائد البلاعم خارج الخلية ودراستها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الالتهاب ، مثل الاستجابات للعدوى والمحفزات المناعية الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعديل لطريقة راسخة تم استخدامها لدراسة مصائد العدلات خارج الخلية.

سيظهر هذا الإجراء رولين شارما. بعد الحصول على البلاعم الرئوية من البشر والفئران عن طريق غسل الشعب الهوائية ، أو BAL ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم التربان الأزرق ومقياس كثافة الدم لإجراء تعداد خلايا قابل للحياة على محلول BAL. الماصة من واحد إلى أربعة مرات من 10 إلى الخامس البلاعم في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع على زلات الغطاء في آبار الألواح المكونة من 24 بئرا ، ثم تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها حتى تلتصق الخلايا.

قم بإزالة وسط الثقافة واستخدم PBS لغسل الخلايا مرة واحدة. ثم أضف 2٪ بارافورمالديهايد - دوريات - ليسين ، أو مثبت PLP ، واحتضان العينات لمدة 10 دقائق. بعد استخدام PBS لغسل الخلايا لفترة وجيزة ، أضف 0.2٪ TWEEN 20 في PBS واحتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، لمنع الخلايا ، أضف 10٪ مصل دجاج في 5٪ BSA ، مخفف في PBS واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم استبدل محلول الكتلة بتركيز واحد إلى 100 من الأجسام المضادة الأولية والتحكم في النظائر واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، استخدم PBS لغسل الخلايا قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المقابلة.

ثم احتضان العينات لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا في PBS ، قم بتركيب العينات باستخدام وسيط التثبيت القائم على DAPI ، ثم تصور العينات باستخدام مجهر متحد البؤر. لمعالجة عينات FFPE بمحلول استرجاع المستضد ، جفف الشرائح في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

ثم انقل الشرائح إلى محلول الزيلين لمدة 30 دقيقة قبل نقل العينات إلى 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد استخدام ماء الصنبور لشطف الشرائح ، ضعها في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة وأخضعها لاسترجاع مستضد أعلى عن طريق وضعها في قدر ضغط بدرجة حموضة Tris-EDTA 9.0 لمدة 10 دقائق. قم بتبريد العينات لمدة 20 دقيقة وانقلها إلى ماء الصنبور.

ثم ضعهم على الروك لمدة خمس دقائق. كرر غسل ماء الصنبور ثم اغسل الشرائح مرة واحدة في PBS على الروك. لمنع العينات ، أضف 10٪ مصل دجاج في 5٪ BSA PBS واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، لتحديد مصائد البلاعم خارج الخلية ، أو METs في البلاعم ، أضف تخفيفا واحدا إلى 100 من الأجسام المضادة الأولية في 1٪ BSA PBS واحتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. استخدم PBS لغسل العينات مرتين على كرسي هزاز لمدة خمس دقائق لكل منهما. أضف الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المقابلة في 1٪ BSA PBS واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.

بعد غسل PBS ، استخدم DAPI الذي يحتوي على وسيط تركيب لتلطيخ الكروماتين وتركيب العينات. باستخدام رأس مسح ليزر متحد البؤر متصل بمجهر مقلوب ، التقط صورا فلورية باستخدام هواء 20X 0.1 NA و 40X 1.0 NA للزيت. التقط صورا أحادية المستوى 512 × 512 بكسل بالنقر فوق زر التسوية المتتابعة للخط.

احصل على ما لا يقل عن 10 حقول رؤية لكل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة. لتلطيخ الأقسام في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، أضف الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة بأحجام 200 ميكرولتر واحتضان العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. اغسل الأقسام في PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

استخدم DAPI لتلطيخ أقسام الرئة في المحلول واحتضان العينات لمدة 20 دقيقة قبل إضافة زلات الغطاء إلى الأقسام الموجودة على شرائح المجهر في PBS. استخدم مجهر متحد البؤر مقلوب مع هدف 40X 1.3 NA ، ومجهز ب 405 نانومتر ، و 440 نانومتر ، و 473 نانومتر ، و 543 نانومتر ، و 635 نانومتر ، لالتقاط الصور وتسجيل مكدسات 3D Z ، بسمك 0.54 ميكرون ، مع تقسيم Z الأمثل. أخيرا ، قم بتحليل الصور وفقا لبروتوكول النص.

هنا مثال على METs في عينة BAL. الميزة الأولى التي يمكن اكتشافها هي حركة النواة إلى حافة الخلية ، كما هو موضح في هذه المرحلة المبكرة من MET التي لها شكل كروي تقريبا. يتبع ذلك الكروماتين خارج الخلية مع وسطاء آخرين مشتركين ، مثل H3Cit والبروتياز الحبيبي ، كما هو موضح في MET الأكثر نضجا.

المرحلة المبكرة من MET هي أعلى اليسار والمرحلة اللاحقة MET أسفل هذا باتجاه المركز. يظهر METs لأنسجة الرئة في هذا الشكل. عندما يتم نفخ الرئتين بالسوائل لتحديد بنية الرئة ، سيتم دفع METs على الجدران السنخية.

سيختلف مورفولوجيا METs أيضا اعتمادا على المستوى الذي تم فيه قطع الأنسجة. يبلغ سمك الأقسام القياسية المستخدمة لعينات أنسجة الرئة من أربعة إلى خمسة ميكرون. تتيح أقسام الأنسجة السميكة التقاط صور متعددة ويمكن بعد ذلك عرض METs في 3D.

تقديم مثال على صورة ثلاثية الأبعاد من أنسجة رئة الفأر مقطوعة في أقسام من 25 إلى 35 ميكرون هنا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين من التلوين بالإضافة إلى التصوير إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون لطيفا مع الغسيل.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الزيمات للإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير عن البروتياز. بعد تطويرها ، قد تمهد هذه التقنية الطريق لدراسة استجابات البلاعم الالتهابية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور METs باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

لا تنس أن العمل مع PLP يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وحماية العين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.