Name: تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر كنفوكل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: اكتشف تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر الكنفوكل في عينات الرئة البشرية والفأرية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة استجابات العدوى والمنبهات المناعية بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة موناش والصحة الوطنية، ومجلس البحوث الطبية، والرئة موناش ومعهد النوم. الكتاب أود أن أشكر موظفي "المناعة السريرية" في الصحة موناش، جودي كالاهان وأليكس فوشيه، كيرستين الجاس وكامدن لو من موناش الصغرى التصوير (MMI) للحصول على تعليمات مع المجهرية [كنفوكل] التصوير، وتقر الكتاب المرافق MMI جامعة موناش. يعترف الكتاب المرافق، وتقديم المساعدة العلمية والتقنية من "منهاج علم الأنسجة موناش".

هذا البروتوكول يتبع التجارب التي تمت الموافقة عليها في: (1) البشر "أخلاقيات اللجنة من موناش الطبي المركز"، والحيوانات (2) لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة ملبورن.
 1-الضامة للفيسيولوجيا الغسل (BAL) <ol><li>"باستخدام ال" الحصول على الضامة الرئة في: الإنسان (1) مواضيع بالقصبات 6، و (2) الفئران باستخدام الشفط داخل الرغامى 13 . 
	ملاحظة: يؤدي الحصول الضامة عموما بعض التنشيط لهذه الخلايا. يتم الحصول على الضامة من المرضى الذين يحتاجون القصبات للتحقيق في مشكلة طبية محتملة وليست جميع المواضيع قد تكون مناسبة لتحليل ميتس (هذا سوف تحتاج إلى تحديد لكل مشروع على حدة).
	<ol><li>تأخذ الحل بال وتدور إلى أسفل (ز 500 x لمدة 10 دقائق) للنموذج بيليه ويغسل مرتين مع الثقافة المتوسطة (روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) مع مصل العجل الجنين 5% و 1% ل الجلوتامين) في درجة حرارة الغرفة، وثم تضعف الخلايا في 4 مل من الثقافة ميدي أم-</li>
		<li>إذا لزم الأمر، طلب رسميا العد التفاضلية؛ ومعظم الخلايا (عموما &#62; 80%) سوف تكون الضامة 6. 
		ملاحظة: هذا سوف عموما أن يؤديها خدمة علم الأنسجة سريرية استخدام مظهر مورفولوجك ل أنواع خلايا مختلفة 6-</li>
		<li>تنفيذ خلية سنخية قابلة للحياة الاعتماد على الحل بال باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير- 
		ملاحظة: الحل بال يتم الحصول عليها من البشر والفئران كما هو مذكور في الخطوة 1، 1-</li>
		<li>إضافة 1-4 × 10 5 الضامة إلى لوحات 24-جيدا في كوفيرسليبس في 500 ميليلتر للثقافة المتوسطة كل بئر وإجازة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية؛ وسوف تلتزم الخلايا كوفيرسليبس. بالنسبة للعينات البشرية، إضافة المضادات الحيوية (مثل البنسلين وستربتوميسين، 10 4 U/mL) لمنع التلوث البكتيري.</li>
	</ol></li></ol> 2. الفلورة التالي/مجهرية من "الضامة بال" ملاحظة: يتم التقيد بها الخلايا على كوفيرسليبس كما هو مذكور أعلاه.
إزالة متوسط الثقافة <ol><li>وغسل الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إصلاح الخلايا في مثبت بارافورمالدهيد/فوق يودات/يسين (حزب العمال التقدمي) 2% للحد الأدنى 10</li>
	<li>يغسل خلايا بإيجاز في برنامج تلفزيوني، وثم بيرميبيليزي في 0.2% 20 توين في برنامج تلفزيوني عن 20 دقيقة</li>
	<li>كتلة الخلايا مع سيرا دجاج 10% في 5% البقري ألبومين المصل (BSA) المخفف في برنامج تلفزيوني عن 30 دقيقة</li>
	<li>إينكوباتي مع مراقبة الابتدائي وايستب الأجسام المضادة ح 1 في درجة حرارة الغرفة بتركيزات 1: 100 (يتم سرد تفاصيل أكثر تحديداً في الجدول للمواد) على 37 درجة مئوية. 
	ملاحظة: للعينات BAL، علامة محددة من الضامة عادة غير مطلوب.</li>
	<li>بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية، تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، وكذلك احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-</li>
	<li>يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع المتوسطة المستندة إلى DAPI المتصاعدة للتصور استخدام مجهر [كنفوكل] (كما ذكر أعلاه) في الليزر الجسيمات 405، 488، 561 و 647 نانومتر و 40 س، غ 1.0 النفط الهدف.</li>
</ol> 3. عينات أنسجة الرئة ملاحظة: في فيفو الدراسات أنسجة الرئة، دراسة العينات بعد التعرض ذات الصلة (مثلاً، كما هو مبين في س &#39; سوليفان et al. 7)-التعرض الأكثر ملاءمة لهذه التجربة هي الكائنات الدقيقة المعدية، خاصة البكتيريا. سلالات الماوس التي يمكن أن تستخدم لهذا الأسلوب من C57BL/6 أو بالب/ج الفئران، 10-12 أسابيع من العمر، والوزن ز 25-30، وذكر-
<ol><li>يوثانيزي الفئران، عن طريق حقنه داخل الكيتامين (400 مغ/كغ) وإكسيلازيني (40 مغ/كغ). فتح تجويف الصدر وفضح الرئتين والقلب باستخدام الملقط الجراحي والمقص.
	<ol><li>بث برنامج تلفزيوني الحار باستخدام إبرة عيار 21 في البطين الأيمن لتغسل الدم من هذه السفن لمدة 30 ثانية، ثم ضخ 10 مل من 2% حزب العمال التقدمي مثبت لمدة 30 s (في البطين الأيمن).</li>
		<li>استخدام برنامج تلفزيوني الحارة (42 درجة مئوية) للغسل تجويف الصدر مفتوحة. التنبيب القصبة الهوائية بإبرة عيار 21 وقطعة من أنابيب 0.8 ملم قطع بحجم، وحقن 800 ميليلتر من المعالجون مسبقاً (إلى 42 درجة مئوية)، ذوبان منخفضة نقطة 3% [اغروس] الحل.</li>
		<li>التعادل قبالة القصبة الهوائية مع الحرير مجدول (4.0 جامعة جنوب المحيط الهادئ). ضع مؤشر ترابط حول القصبة الهوائية، أسفل نقطة الإدراج من القنية، وضمان الحصول عليها عن طريق تراكم عقده بسيطة. أن يصلب [اغروس]، إدارة برنامج تلفزيوني المثلج حول الرئتين. إزالة الرئتين والقلب ككتلة من تجويف الصدر باستخدام مقص وتشريح كليلة. إزالة الرئة كل على حدة ومن ثم إصلاحها لهم ح 16 في 2% حزب العمال التقدمي أو الفورمالين في 4 ° C.</li>
		<li>تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تقطيع الأنسجة. وكانت هذه الأساليب للحصول على أنسجة الرئة هو موضح سابقا 13-</li>
	</ol></li> <li>لتحضير أنسجة الرئة نماذج استخدام الخطوات التالية.
	<ol><li>فيكس الرئة الأنسجة (مستأصل في الخطوة 3، 1) الأنسجة في 10% فورمالين الطبيعية معزولة عن 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. نقل إلى الإيثانول 75% ووضع في معالج أنسجة على دورة ح 12، (2.5 ح في 75% EtOH، ح 3 في EtOH المطلق، ح 3.5 في 3B المذيبات، وعن ح 3 في البارافين).</li>
		<li>Embed في البارافين القياسية لإنشاء ثابت من الفورمالين، وجزءاً لا يتجزأ من البارافين كتل (FFPE) التي يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة- 
		ملاحظة: في هذه المرحلة، عموما مريحة لقطع المقاطع الرئة للشرائح القياسية.</li>
		<li>قطع المقاطع الرئة FFPE في 4-5 ميكرون سمك باستخدام مبضع وجبل على المتهمين، المغلفة الشرائح كما تم وصفه سابقا قبل س &#39; سوليفان et al. 7</li> <li>لتحميل الشرائح ووضع 3 قطرات متوسطة المتصاعدة على 60 مم × 24 مم كوفيرسليبس (الحجم 1.5)، وعكس الشريحة ساترة وطرد المتوسطة الزائدة. مغلقة بأحكام ختم مع طلاء الأظافر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-</li>
	</ol></li></ol> 4. إعداد/الفحص المجهري "عينات أنسجة الرئة" <ol><li>لإزالة الشمع وترطيب بريتريت عينة أنسجة الرئة FFPE مع مستضد استرجاع الحل.
	الشرائح فب <ol><li>الفرن الجاف لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ثم وضع الشرائح في الحل زيلين نفط 30 دقيقة ونقل إلى الحل الإيثانول 70% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الشطف بماء الصنبور.</li>
		<li>مكان في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة، ورهنا باسترجاع مستضد هير في طنجرة الضغط لمدة 10 دقائق في 10 m/mol/L تريس، 1 ملمول/يدتا pH 9.0. باردة ل 20 دقيقة أغسل مرتين في مياه الحنفية لمدة 5 دقائق في الروك، ثم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في الروك.</li>
		<li>كتلة مع المصل الدجاج 10% في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-</li>
	</ol></li> <li>وصمة عار في الأنسجة.
	<ol><li>لتحديد ميتس في الضامة، إضافة الأجسام المضادة الأولية (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني عن ح 16 عند 4 درجة مئوية في تمييع 1/100 (يتم سرد تفاصيل محددة عن كميات الضد في الجدول للمواد). أغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الروك.</li>
		أضداد <li>تحقيق كشف فلوري بالحضانة مع الثانوية المقابلة في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الأضداد:: (1) الدجاج المضادة الماوس 488 (الأخضر) والماعز (2) الدجاج لمكافحة 594 (أحمر) والماوس المضادة (3) حمار 647 (الأحمر الآن)-</li>
		<li>يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع تصاعد المحتوية على DAPI المتوسطة لتلطيخ الكروماتين.</li>
	</ol></li> <li>الحصول على الصور الفلورية باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح رئيس تعلق مجهر مقلوب.
	<ol><li>تثير الإعداد مع 405، 488، 561، و 647 نانومتر الليزر. التقاط صور بكسل-512 × 512 طائرة واحدة بالنقر فوق خط تسلسلي، والاستواء زر (في المتوسط سطر 2) استخدام 20 X 0.1 الهواء NA و NA 40 × 1.0 النفط الأهداف.</li>
		<li>الحصول على مالا يقل عن عشرة حقول لعرض كل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة (أي، 10 عالية الطاقة الحقول لعرض (هفوف) لعنصر التحكم، 10 لحفز عينة، إلخ، لكل الماوس)- 
		ملاحظة: للحصول على عينة تمثيلية من الميدان كله، نظام مصفوفة يمكن استخدامها في الحقل الذي يتم تقسيم إلى أقسام مختلفة و لكل عينة مختلفة تستخدم نفس مصفوفة لتحديد الحقول من طريقة العرض (مثلاً، يمكن تقسيم الحقل إلى 9 أقسام، وتتخذ من المركز وزوايا 4، هفوف اثنين)-</li>
	</ol></li></ol> 5. التصوير ميتس ثلاثية الأبعاد (3-D) ملاحظة: كما ميتس هياكل ثلاثية الأبعاد، بأخذ z-المكدس متعددة الصور، والتي يتم تشكيلها، قد تعطي معلومات قيمة-
<ol><li>المقطع العينات الرئة من كتل البارافين، في 200 ميكرومتر استخدام فيبرتوم في سعة تعيين 1.8 ملم والسرعة من 0.1-0.5 ملم/س.</li>
	<li>كتلة أنسجة الرئة مع 20 ٪ مصل كل منهما (10% مصل العجل الجنين والمصل الدجاج 10 ٪)، وثم بيرميبيليزي في تكملة برنامج تلفزيوني و 3.75% 100 تريتون العاشر ح 7 في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات لطيف.</li>
	<li>وصمة عار المقاطع ح 16 عند 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في مجلدات ميليلتر 200 في أنابيب ميكروسينتريفوجي (جسم التركيزات المذكورة في الجدول للمواد)-</li>
	<li>أغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني، 3 مرات لمدة 10 دقيقة قبل تفرخ مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة في درجة حرارة الغرفة حاء – 1</li>
	<li>وصمة عار أقسام الرئة ل DAPI (1:5، 000) في الحل لمدة 20 دقيقة، قبل إضافة كشوف غطاء للمجهر الشرائح في برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] مقلوب ال (40 × 1.3 غ) مجهزة 405 نانومتر، 440 نانومتر، 473 نانومتر، 543 نانومتر، و 635 نانومتر الليزر.</li>
	<li>سجل ثلاثية الأبعاد z-رزمة من 0.54 ميكرون سمك مع تقطيع ض الأمثل لهدف النفط غ 40 × 1.3. 
	ملاحظة: تتنوع البرمجيات المستخدمة تبعاً للمجهر الفردية. مثال عن كيف يمكن استخدام البرنامج مجهر واحد يرد في التكميلية الملف 1-</li>
</ol> 6. صورة التحليل ملاحظة: تحليل العينات يتطلب استخدام برمجيات تحليل التصوير محددة وأمثلة مذكورة في الجدول للمواد. في حين يعتمد على برنامج معين يستخدم تحليل النتائج، النقاط المدرجة أدناه هامة-
<ol><li>عينات "التحليل بال" <ol><li>تعريف عدد الضامة باختيار قناة الأزرق ل DAPI وتعيين حجم الحد أدنى للخلايا (مثلاً، &#62; 18 ميكرومتر في القطر). باستخدام البرمجيات ذات الصلة، وقياس مجموع الضامة كل حقل-</li>
		<li>حساب عدد الخلايا التي تحتوي على ميزات يلتقي بوجود خارج الخلية الكروماتين الكشف عنها بواسطة DAPI مع التعبير المشترك عن علامات أخرى (مثلاً، MMP12، PAD2 و H3Cit)- 
		ملاحظة: يعتمد عدد العلامات التي يمكن تحليلها على العدد من أجهزة الليزر المتوفرة، ولكن من الناحية المثالية بالإضافة إلى DAPI، اثنين على الأقل من علامات أخرى ينبغي إدراجها. أخرى أقل معلمات محددة للتعبير MET (مثلاً، عدد الخلايا التي تحتوي على الكروماتين خارج الخلية، ونواة موسع) يمكن استخدامها-</li>
		<li>لمقارنة التعبير MET في بال تحليل عينات (بين التحكم والدخان، والدخان/الدناز معاملة مجموعات)، الحد ني الضامة ال 100 كل عينة.</li>
		<li>لقياس الأجسام المضادة الثانوية وايستب التحكم في مستويات الأسفار؛ وقياس الحد ني خلايا 100 في كل عينة لهذه الأسفار. قياس مستوى متوسط من الأسفار الخلفية لكل علامة (مثلاً، H3Cit) باستخدام البرامج القياسية.</li>
		<li>إلى تعريف تعبير MET، عد الخلايا مع النمط الظاهري نموذجي (مثلاً، الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9) وكل MET، لقياس مستوى الأسفار علامات (مثلاً، H3Cit و MMP9). استبعاد الخلايا المنتجة ميتس إذا لم يكن على تلطيخ فوق عنصر التحكم في الخلفية وايستب.</li>
		<li>تحليل للعينات بال البشرية، كحد أدنى من 100 خلية لكل عينة للنسبة مئوية الضامة التي تجعل ميتس. للحصول على نماذج مورين، تحليل الخلايا أصغر وصعوبة تحديد ميتس، عدد أكبر من الخلايا لكل عينة (مثلاً، الضامة 200)-</li>
	</ol></li> <li>تحليل عينات أنسجة الرئة <ol><li>لتحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة، استخدم علامة بلعم محددة مثل F4/80-</li>
		<li>تحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة باستخدام التعريب المشارك F4/80 في الخلايا التي تعبر عن الكروماتين خارج الخلية مع معلمات أخرى كما هو موضح في القسم 6.1.</li>
		<li>تحديد مستويات الخلفية الفلورية في عينات مع الأجسام المضادة الثانوية وعناصر التحكم ايستب. استبعاد ميتس من التحليل أن لا تتجاوز الخلفية.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+immunol%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1(2013).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371(2015).</li>
<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PAD4+in+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360(2012).</li>
<li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li>
<li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling%2FMechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li>
<li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li>
</ol>

الكتاب قد لا الكشف جعل فيما يتصل بهذا العمل.

ويستند الأسلوب الموصوفة في هذا الاستعراض على أن تستخدم لتحديد وجود شبكات14. الضامة تعتبر إلى حد بعيد نوع الخلية المهيمنة في عينات بال وهذا الأسلوب من جمع خاصة مناسبة لدراسة ميتس. إذا كانت خلايا الدم الحمراء موجودة في ال، ينبغي تفكيك هذه الخلايا باستخدام كلوريد الأمونيوم. سيتم تنشيط الإجراء BAL عموما الضامة و ولذلك فمن المتوقع أنه سيكون هناك ميتس موجودة في العينات تنشيط الأمم المتحدة. الضامة BAL عادة ملتصقة جداً. عموما لا الضامة BAL ستحتاج إلى علامة معينة كما هذه الخلايا هي نوع الخلية المهيمنة ويمك...

ووصفت الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات)، أولاً برينكمان et al. 1 يتم إنتاجها في الغالب استجابة للعدوى (خاصة للبكتيريا) ولها دور هام في الدفاع المضيف1،2. قد وصفت أيضا تحدث استجابة للأمراض غير المعدية، بما في ذلك التهاب الأوعية الدموية والذئبه الحمامية الجهازية (SLE)؛ وإلى mitogen phorbol 12-ميريساتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)2،3. وقد اعترف مؤخرا أن أنواع الخلايا الأخرى قد تنتج أيضا الفخاخ خارج الخلية، بما في ذلك الضامة. بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس) ليست بعد كيان محدد جيدا في الأدب4،5. وقد أنشأنا مؤخرا أساليب الكشف عن وجود ميتس في المختبر و في فيفو6،7. في هذه المقالة، سيتم وصف قياس ميتس استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
السمات الرئيسية نيتوسيس التي تميزها عن سائر المسارات الخلوية (مثل المبرمج8) هي النتوء الكروماتين بالاقتران مع: (1) سيترولينيشن هيستونيس (H3Cit)9، (2) التعبير المشارك من البروتياز الحبيبية10 ، ومشاركة بيبتيديل ارجينين ديميناسي (PAD) 4 (3)11،12. الضامة أيضا أن أعرب عن H3Cit، البروتياز الحبيبية، ومنصة، ويمكن استخدام هذه الميزات لتحديد وجود ميتس.
قد يكون ميتس دوراً بالغ أهمية في الرئة، كما بلعم هو المهيمن الخلية الحالية في الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية في الرئة والدور الأولى في توجيه الاستجابة المناعية الخلوية للعدوى/التهاب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما الكثير من الرئة مساحة فارغة (مثلاً، داخل الحويصلات الهوائية)، ميتس، يحتمل أن تكون قادرة على التوسع في المساحة المتوفرة، على النقيض من الأجهزة الصلبة.
الأسلوب الأكثر استخداماً لتحديد وجود شبكات بالفحص المجهري [كنفوكل]. لا توجد حتى الآن طريقة محددة بوضوح لقياس ميتس. هذه التقنية لقياس شبكات تم تكييف لقياس وجود ميتس في هذا البروتوكول. المتطلبات الرئيسية لهذا الأسلوب هي الوصول إلى الفحص المجهري [كنفوكل] وبرامج التصوير المناسبة للتحليل.

<table><tbody><tr><td><قوية >عينات بشرية: الأجسام المضادة الأولية < / قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>أرنب مضاد للإنسان H3Cit (Citrulline R26) Abcam</td><td></td> <td>AB5103</td><td>10 ميكروغرام / مل</td></tr><tr><td>أرنب مضاد للإنسان MMP12</td><td>Novus البيولوجي</td><td>NB110-57214</td><td>1: 100 تركيز غير قابل للقياس</td></tr><tr><td>الكمي الفأر المضاد للإنسان MMP9</td><td>Novus البيولوجي</td><td>AB119906</td><td>1: 200 استسقاء ، بدون تركيز بالنظر</td></tr><tr><td>إلى الأرنب المضاد للإنسان PADI2 / PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ميكروغرام / مل</td></tr><tr><td>فأر مضاد للإنسان PADI4 / PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ميكروغرام / مل</td></tr><tr><td>الأغنام المضادة للإنسان NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug / ml</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Catalog Number</td><td>تعليقات < / قوية ></td></tr> <tr><td>< قوية > عينات من الفأر: الأجسام المضادة الأولية < / قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>الماعز مضاد للفأر MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ميكروغرام / مل</td></tr><tr><td>أرنب مضاد للفأر H3Cit (Citrulline R26) Abcam</td><td></td> <td>AB5103</td><td>10 ميكروغرام / مل</td></tr><tr><td>الفئران المضادة للفأر F4 / 80</td><td>داخلي (ورم هجين)</td> <td>في المنزل</td><td>20 ميكروغرام / مل</td></tr><tr><td>الأغنام المضادة للإنسان المضادة للإنسان HNE / NE</td><td>الياقوت Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ميكروغرام / مل</td></tr><tr><td>فأر مضاد للإنسان وخجول ؛ وخجول. وخجول. وخجول. PADI4 / PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ميكروغرام / مل</td></tr><tr><td>شرائح سوبر فروست بلس Menzel</td><td></td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>المجسات الجزيئية</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الأمونيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> الشركة</td><td> رقم الكتالوج</td><td>تعليقات</td></tr><tr><td> الأجسام المضادة الثانوية </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>دجاج مضاد للأرانب AF 488 /</td> <td>تقنيات الحياة</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>الدجاج المضاد للأرانب AF 594</td><td>تقنيات الحياة</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>الدجاج المضاد للماعز AF 594</td><td>الحياة تقنيات</td><td>A-21468</td><td></td></tr><tr><td>الدجاج المضاد للفأر AF488</td><td>تقنيات الحياة</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>الحمار المضاد للأغنام AF 594</td><td>تقنيات الحياة</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>الدجاج المضاد للفأر AF 647</td><td>تقنيات الحياة</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>الحمار المضاد للأغنام AF 594</td><td>تقنيات الحياة</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr>التحكم <td></td><td></td> في<td>النمط المتشاوي</td><td></td></tr><tr><td>أرنب IgG</td><td>في المنزل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أرنب IgG</td><td>في المنزل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ماوس IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>أرنب IgG</td><td>في المنزل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ماوس IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>الأغنام IgG</td><td>في المنزل</td><td></td><td></td></tr> <tr><td><قوي > الاسم < قوي></td><td><قوي>الشركة</قوي></td><td><قوي>رقم الكتالوج</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software Programs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>لمتوسط شدة الفلورفورات يمكن استخدام تطبيق مكتبي قياسي مثل Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><قوي>الاسم</قوي></td><td><قوي>الشركة</td><td> رقم الكتالوج</td><td>تعليقات</td></tr><tr><td>مجاهر</قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 مجهر المسح الضوئي متحد البؤر</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 مجهر المسح الضوئي متحد البؤر</td><td>أوليمبوس</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tissue sources</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL من جناح تنظير القصبات في مركز</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>موناش الطبيعينات الفئران BAL وأنسجة الرئة من قسم علم الأدوية بجامعة ملبورن.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>مصل ربلة الساق الجنينية</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>أخرى كواشف </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan الأسود</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>المثبت بارافورمالدهيد / دوريات / ليسين (PLP)</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>زيلين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>الكيتامين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>الفورمالين الطبيعي</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>البارافين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>أغاروز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>مذيب 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 12 مل</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 60 × 24 مل</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>الفئران< / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 أسود 6</td><td>منصة أبحاث حيوانية موناش (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB / c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

وسيلة الرئيسية المستخدمة لتحديد وجود العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) [كنفوكل] مجهرية. وقد قمنا بتعديل أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] ثابتة لتصور بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس). يتم تعريف هذه الفخاخ خارج الخلية بوجود الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك لمكونات أخرى مثل البروتياز الحبيبية وهيستونيس سيتروليناتيد بيبتيديل أرجيناسي ديميناسي (PAD). التعبير عن ميتس عموما يقاس بعد التعرض لحافز ومقارنة عينات تنشيط الأمم المتحدة. عينات مدرجة أيضا للتحكم بالخلفية وايستب. ويتم تحليل الخلايا باستخدام برمجيات التحليل صورة واضحة المعالم. يمكن استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتحديد وجود ميتس على حد سواء في المختبر و في فيفو في أنسجة الرئة.

وقد تصور ميتس من عينات BAL، في أنسجة الرئة وفي أقسام الرئة أكثر سمكا مع صور ثلاثية الأبعاد. ويرد مثال ميتس تصور في عينة بال في الشكل 1. مورفولوجية ميتس ستختلف وفقا لمرحلة النضج. أول ميزة يمكن كشفها في الفحص المجهري هو حركة نواة إلى الحافة من الخلية. ويعقب هذا الكروماتين خارج الخلية مع الوسطاء أعرب المشترك الأخرى، مثل البروتياز H3Cit والحبيبة. الخلية في المراحل السابقة، لا يزال لديه شكل كروي تقريبا مع فخ خارج الخلية وأعرب عن. في مراحل لاحقة، وتشكيل MET تتميز ب...

بلعم الفخاخ خارج الخلية كيان وصف حديثا. هذه المادة سوف تركز على أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] وكيف أنها تصور في المختبر و في فيفو من عينات الرئة.

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

الهدف العام من هذه الطريقة هو توضيح كيف يمكن تصور مصائد البلاعم خارج الخلية ودراستها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الالتهاب ، مثل الاستجابات للعدوى والمحفزات المناعية الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعديل لطريقة راسخة تم استخدامها لدراسة مصائد العدلات خارج الخلية.سيظهر هذا الإجراء رولين شارما. بعد الحصول على البلاعم الرئوية من البشر والفئران عن طريق غسل الشعب الهوائية ، أو BAL ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم التربان الأزرق ومقياس كثافة الدم لإجراء تعداد خلايا قابل للحياة على محلول BAL. الماصة من واحد إلى أربعة مرات من 10 إلى الخامس البلاعم في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع على زلات الغطاء في آبار الألواح المكونة من 24 بئرا ، ثم تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها حتى تلتصق الخلايا.قم بإزالة وسط الثقافة واستخدم PBS لغسل الخلايا مرة واحدة. ثم أضف 2٪ بارافورمالديهايد - دوريات - ليسين ، أو مثبت PLP ، واحتضان العينات لمدة 10 دقائق. بعد استخدام PBS لغسل الخلايا لفترة وجيزة ، أضف 0.2٪ TWEEN 20 في PBS واحتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة.بعد ذلك ، لمنع الخلايا ، أضف 10٪ مصل دجاج في 5٪ BSA ، مخفف في PBS واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم استبدل محلول الكتلة بتركيز واحد إلى 100 من الأجسام المضادة الأولية والتحكم في النظائر واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، استخدم PBS لغسل الخلايا قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المقابلة.ثم احتضان العينات لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا في PBS ، قم بتركيب العينات باستخدام وسيط التثبيت القائم على DAPI ، ثم تصور العينات باستخدام مجهر متحد البؤر. لمعالجة عينات FFPE بمحلول استرجاع المستضد ، جفف الشرائح في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.ثم انقل الشرائح إلى محلول الزيلين لمدة 30 دقيقة قبل نقل العينات إلى 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد استخدام ماء الصنبور لشطف الشرائح ، ضعها في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة وأخضعها لاسترجاع مستضد أعلى عن طريق وضعها في قدر ضغط بدرجة حموضة Tris-EDTA 9.0 لمدة 10 دقائق. قم بتبريد العينات لمدة 20 دقيقة وانقلها إلى ماء الصنبور.ثم ضعهم على الروك لمدة خمس دقائق. كرر غسل ماء الصنبور ثم اغسل الشرائح مرة واحدة في PBS على الروك. لمنع العينات ، أضف 10٪ مصل دجاج في 5٪ BSA PBS واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك ، لتحديد مصائد البلاعم خارج الخلية ، أو METs في البلاعم ، أضف تخفيفا واحدا إلى 100 من الأجسام المضادة الأولية في 1٪ BSA PBS واحتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. استخدم PBS لغسل العينات مرتين على كرسي هزاز لمدة خمس دقائق لكل منهما. أضف الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المقابلة في 1٪ BSA PBS واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.بعد غسل PBS ، استخدم DAPI الذي يحتوي على وسيط تركيب لتلطيخ الكروماتين وتركيب العينات. باستخدام رأس مسح ليزر متحد البؤر متصل بمجهر مقلوب ، التقط صورا فلورية باستخدام هواء 20X 0.1 NA و 40X 1.0 NA للزيت. التقط صورا أحادية المستوى 512 × 512 بكسل بالنقر فوق زر التسوية المتتابعة للخط.احصل على ما لا يقل عن 10 حقول رؤية لكل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة. لتلطيخ الأقسام في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، أضف الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة بأحجام 200 ميكرولتر واحتضان العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. اغسل الأقسام في PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.استخدم DAPI لتلطيخ أقسام الرئة في المحلول واحتضان العينات لمدة 20 دقيقة قبل إضافة زلات الغطاء إلى الأقسام الموجودة على شرائح المجهر في PBS. استخدم مجهر متحد البؤر مقلوب مع هدف 40X 1.3 NA ، ومجهز ب 405 نانومتر ، و 440 نانومتر ، و 473 نانومتر ، و 543 نانومتر ، و 635 نانومتر ، لالتقاط الصور وتسجيل مكدسات 3D Z ، بسمك 0.54 ميكرون ، مع تقسيم Z الأمثل. أخيرا ، قم بتحليل الصور وفقا لبروتوكول النص.يظهر هنا مثال على METs في عينة BAL. الميزة الأولى التي يمكن اكتشافها هي حركة النواة إلى حافة الخلية ، كما هو موضح في هذه المرحلة المبكرة من MET التي لها شكل كروي تقريبا. يتبع ذلك الكروماتين خارج الخلية مع وسطاء آخرين مشتركين ، مثل H3Cit والبروتياز الحبيبي ، كما هو موضح في MET الأكثر نضجا.المرحلة المبكرة من MET هي أعلى اليسار والمرحلة اللاحقة MET أسفل هذا باتجاه المركز. يظهر METs لأنسجة الرئة في هذا الشكل. عندما يتم نفخ الرئتين بالسوائل لتحديد بنية الرئة ، سيتم دفع METs على الجدران السنخية.سيختلف مورفولوجيا METs أيضا اعتمادا على المستوى الذي تم فيه قطع الأنسجة. يبلغ سمك الأقسام القياسية المستخدمة لعينات أنسجة الرئة من أربعة إلى خمسة ميكرون. تتيح أقسام الأنسجة السميكة التقاط صور متعددة ويمكن بعد ذلك عرض METs في 3D.يتم تقديم مثال على صورة ثلاثية الأبعاد من أنسجة رئة الفأر مقطوعة في أقسام من 25 إلى 35 ميكرون هنا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين من التلوين بالإضافة إلى التصوير إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون لطيفا مع الغسيل.باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الزيمات للإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير عن البروتياز. بعد تطويرها ، قد تمهد هذه التقنية الطريق لدراسة استجابات البلاعم الالتهابية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور METs باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.لا تنس أن العمل مع PLP يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وحماية العين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات) هي آلية هامة لمكافحة المناعة الفطرية المسببة للأمراض البكتيريا والفطريات والطفيليات. نحن هنا وصف الأساليب المحببة لعزل العدلة من دم الإنسان وتفعيلها على شكل الشباك. نقدم تقنيات إعداد تصور المستجدة في ضوء الفحص المجهري والإلكترون.

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

ووصف طريقة لتحديد فردي ، والتعامل معها ، ومسببات الأمراض الصورة الحية باستخدام فخ البصرية بالإضافة إلى المجهر القرص الغزل. فخ البصرية يوفر سيطرة المكاني والزماني للكائنات الحية والأماكن المجاورة لها إلى الخلايا المضيفة. مضان المجهري التفاعلات بين الخلايا الحيوية يلتقط مع الحد الأدنى من اضطراب في الخلايا.

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا للتلوين المناعي والتصور القائم على الفحص المجهري متحد البؤر لمصائد البلاعم خارج الخلية (METs) في أنسجة رئة الفئران. تتميز البلاعم المقيمة في الأنسجة بالتعبير عن علامة البروتين السكري السطحية F4 / 80 الخاصة بالبلاعم ، بينما يتم تصور METs من خلال تسمية مصفوفة علامات MET بالبروتيناز المعدني 9 ، والهيستون H3 الرقيق ، والكروماتين خارج الخلية.

توصيف مصائد البلاعم خارج الخلية في عينات أنسجة رئة الفئران

يوضح هذا الفيديو الوسم المناعي لمصائد البلاعم خارج الخلية ، METs ، في البلاعم السنخية القصبية من سائل الغسيل القصبي السنخي ، وتصورها باستخدام المجهر متحد البؤر.

تصور المصائد خارج الخلية في البلاعم من سوائل غسل الشعب الهوائية البشرية

يوضح هذا الفيديو التحفيز المختبري لمصائد البلاعم خارج الخلية (METs) في البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة باستخدام محفزات التهابية مختلفة مثل TNF-alpha و PMA و HOCL. يوضح الفيديو أيضا طريقة تلطيخ صبغة SYTOX ل METs للتصور.

التحفيز في المختبر وتصور مصائد البلاعم خارج الخلية

نصف إعدادا تجريبيا لتصور تكوين البلعمة عالية الدقة غير المسبوقة وإغلاقه في ثلاثة أبعاد في البلاعم الحية ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي. يسمح بمراقبة قاعدة الكأس البلعمية ، والأرجل الكاذبة الممتدة ، بالإضافة إلى الموقع الدقيق لقص البلعمة.

&quot;يبلوع إغلاق الفحص&quot; لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)

هنا يمكننا وصف أساليب استخدام الغزل القرص المجهري [كنفوكل] إلى أحداث متجولة واحد الصورة بالماوس الضامة البريتوني المقيم. ويمكن تمديد البروتوكولات إلى خلايا أخرى متجولة.

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) هي هياكل ثلاثية الأبعاد ولدت من قبل المحببات العدلات حفز. وقد أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن الـ NETs تشارك في مجموعة واسعة من الأمراض. وقد يكون للكشف عن الـ NETs في الأنسجة أهمية تشخيصية، ولذلك يلزم وضع بروتوكولات موحدة لوضع العلامات على مكونات الشبكة.

وضع العلامات المناعية للفخاخ خارج الخلية البشرية ومورين العدلات في الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ

المقدمة هنا هو بروتوكول للكشف عن الإنتاج الضام (MET) فخ خارج الخلية في ثقافة الخلايا الحية باستخدام المجهر وتلطيخ فلوري. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لدراسة محدده علامات البروتين التقي بتلطيخ المناعي.

في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة

يظهر هنا بروتوكول لتحريض وتحليل مصائد العدلات خارج الخلية في المختبر (NETs). أسفر القياس الكمي للحمض النووي والكاثيليسيدين (LL37) ونشاط الإنزيم عن بيانات تظهر التباين في تكوين ومورفولوجيا الشبكات التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية في ظل ظروف مضبوطة مماثلة.

التحليل المورفولوجي والتركيبي لمصائد العدلات خارج الخلية التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية

ترتبط مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بأمراض مختلفة ، وغالبا ما يستخدم التألق المناعي لتصورها. ومع ذلك ، هناك العديد من بروتوكولات التلوين ، وفي كثير من الحالات ، يتم فحص نوع واحد فقط من الأنسجة. هنا ، نضع بروتوكولا قابلا للتطبيق بشكل عام لتلطيخ الشبكات في الفئران والأنسجة البشرية.

التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر

اكتشف تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر الكنفوكل في عينات الرئة البشرية والفأرية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة استجابات العدوى والمنبهات المناعية بدقة.

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

استكشف المزيد من الفيديوهات