تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]
أكتوبر 19, 2017
بلعم الفخاخ خارج الخلية كيان وصف حديثا. هذه المادة سوف تركز على أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] وكيف أنها تصور في المختبر و في فيفو من عينات الرئة.
الهدف العام من هذه الطريقة هو توضيح كيف يمكن تصور مصائد البلاعم خارج الخلية ودراستها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الالتهاب ، مثل الاستجابات للعدوى والمحفزات المناعية الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعديل لطريقة راسخة تم استخدامها لدراسة مصائد العدلات خارج الخلية.
سيظهر هذا الإجراء رولين شارما. بعد الحصول على البلاعم الرئوية من البشر والفئران عن طريق غسل الشعب الهوائية ، أو BAL ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم التربان الأزرق ومقياس كثافة الدم لإجراء تعداد خلايا قابل للحياة على محلول BAL. الماصة من واحد إلى أربعة مرات من 10 إلى الخامس البلاعم في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع على زلات الغطاء في آبار الألواح المكونة من 24 بئرا ، ثم تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها حتى تلتصق الخلايا.
قم بإزالة وسط الثقافة واستخدم PBS لغسل الخلايا مرة واحدة. ثم أضف 2٪ بارافورمالديهايد - دوريات - ليسين ، أو مثبت PLP ، واحتضان العينات لمدة 10 دقائق. بعد استخدام PBS لغسل الخلايا لفترة وجيزة ، أضف 0.2٪ TWEEN 20 في PBS واحتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك ، لمنع الخلايا ، أضف 10٪ مصل دجاج في 5٪ BSA ، مخفف في PBS واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم استبدل محلول الكتلة بتركيز واحد إلى 100 من الأجسام المضادة الأولية والتحكم في النظائر واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، استخدم PBS لغسل الخلايا قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المقابلة.
ثم احتضان العينات لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا في PBS ، قم بتركيب العينات باستخدام وسيط التثبيت القائم على DAPI ، ثم تصور العينات باستخدام مجهر متحد البؤر. لمعالجة عينات FFPE بمحلول استرجاع المستضد ، جفف الشرائح في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
ثم انقل الشرائح إلى محلول الزيلين لمدة 30 دقيقة قبل نقل العينات إلى 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد استخدام ماء الصنبور لشطف الشرائح ، ضعها في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة وأخضعها لاسترجاع مستضد أعلى عن طريق وضعها في قدر ضغط بدرجة حموضة Tris-EDTA 9.0 لمدة 10 دقائق. قم بتبريد العينات لمدة 20 دقيقة وانقلها إلى ماء الصنبور.
ثم ضعهم على الروك لمدة خمس دقائق. كرر غسل ماء الصنبور ثم اغسل الشرائح مرة واحدة في PBS على الروك. لمنع العينات ، أضف 10٪ مصل دجاج في 5٪ BSA PBS واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، لتحديد مصائد البلاعم خارج الخلية ، أو METs في البلاعم ، أضف تخفيفا واحدا إلى 100 من الأجسام المضادة الأولية في 1٪ BSA PBS واحتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. استخدم PBS لغسل العينات مرتين على كرسي هزاز لمدة خمس دقائق لكل منهما. أضف الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المقابلة في 1٪ BSA PBS واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
بعد غسل PBS ، استخدم DAPI الذي يحتوي على وسيط تركيب لتلطيخ الكروماتين وتركيب العينات. باستخدام رأس مسح ليزر متحد البؤر متصل بمجهر مقلوب ، التقط صورا فلورية باستخدام هواء 20X 0.1 NA و 40X 1.0 NA للزيت. التقط صورا أحادية المستوى 512 × 512 بكسل بالنقر فوق زر التسوية المتتابعة للخط.
احصل على ما لا يقل عن 10 حقول رؤية لكل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة. لتلطيخ الأقسام في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، أضف الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة بأحجام 200 ميكرولتر واحتضان العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. اغسل الأقسام في PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
استخدم DAPI لتلطيخ أقسام الرئة في المحلول واحتضان العينات لمدة 20 دقيقة قبل إضافة زلات الغطاء إلى الأقسام الموجودة على شرائح المجهر في PBS. استخدم مجهر متحد البؤر مقلوب مع هدف 40X 1.3 NA ، ومجهز ب 405 نانومتر ، و 440 نانومتر ، و 473 نانومتر ، و 543 نانومتر ، و 635 نانومتر ، لالتقاط الصور وتسجيل مكدسات 3D Z ، بسمك 0.54 ميكرون ، مع تقسيم Z الأمثل. أخيرا ، قم بتحليل الصور وفقا لبروتوكول النص.
يظهرهنا مثال على METs في عينة BAL. الميزة الأولى التي يمكن اكتشافها هي حركة النواة إلى حافة الخلية ، كما هو موضح في هذه المرحلة المبكرة من MET التي لها شكل كروي تقريبا. يتبع ذلك الكروماتين خارج الخلية مع وسطاء آخرين مشتركين ، مثل H3Cit والبروتياز الحبيبي ، كما هو موضح في MET الأكثر نضجا.
المرحلة المبكرة من MET هي أعلى اليسار والمرحلة اللاحقة MET أسفل هذا باتجاه المركز. يظهر METs لأنسجة الرئة في هذا الشكل. عندما يتم نفخ الرئتين بالسوائل لتحديد بنية الرئة ، سيتم دفع METs على الجدران السنخية.
سيختلف مورفولوجيا METs أيضا اعتمادا على المستوى الذي تم فيه قطع الأنسجة. يبلغ سمك الأقسام القياسية المستخدمة لعينات أنسجة الرئة من أربعة إلى خمسة ميكرون. تتيح أقسام الأنسجة السميكة التقاط صور متعددة ويمكن بعد ذلك عرض METs في 3D.
يتمتقديم مثال على صورة ثلاثية الأبعاد من أنسجة رئة الفأر مقطوعة في أقسام من 25 إلى 35 ميكرون هنا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين من التلوين بالإضافة إلى التصوير إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون لطيفا مع الغسيل.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الزيمات للإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير عن البروتياز. بعد تطويرها ، قد تمهد هذه التقنية الطريق لدراسة استجابات البلاعم الالتهابية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور METs باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.
لا تنس أن العمل مع PLP يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وحماية العين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تركز هذه المقالة على تصور مصائد الخلايا البانية خارج الخلية باستخدام تقنيات المجهر المجسم. وتناقش الأساليب المستخدمة في المختبر وفي الجسم الحي على عينات الرئة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- علم الأحياء الخلوي
- تقنيات المجهر
الخلفية
- مصائد الخلايا البانية خارج الخلية هي كيان موصوف حديثًا.
- فهم دورها في الالتهاب ضروري لأبحاث الاستجابة المناعية.
- المجهر المجسم هو أداة قوية لتصور هذه الهياكل.
- تعتمد هذه الطريقة على التقنيات المستخدمة لدراسة مصائد الخلايا العدلية خارج الخلية.
هدف الدراسة
- لإثبات تصور مصائد الخلايا البانية خارج الخلية.
- لاستكشاف الاستجابات للعدوى والمحفزات المناعية.
- لتوفير بروتوكول مفصل للباحثين في هذا المجال.
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا البانية من الرئتين للإنسان والفئران عن طريق غسل القصبات الهوائية (BAL).
- عد الخلايا الحية باستخدام أزرق تريبان وعداد الخلايا.
- زراعة الخلايا على شرائح زجاجية في أطباق 24 فجوة.
- حضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية للتصاق.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لمصائد الخلايا البانية خارج الخلية.
- إثبات فعالية الأسلوب في دراسة الاستجابات المناعية.
- تحسين البروتوكولات لزيادة الوضوح والتكرارية.
- المساهمة في فهم وظائف الخلايا البانية في الالتهاب.
الاستنتاجات
- طريقة المجهر المجسم فعالة لدراسة مصائد الخلايا البانية خارج الخلية.
- يمكن لهذه التقنية أن تتقدم بأبحاث الالتهاب والاستجابات المناعية.
- يمكن للدراسات المستقبلية أن تعتمد على هذه المنهجية لاستكشاف الآثار المترتبة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Visualizing macrophage extracellular traps (METs) provides a mechanistic readout of innate immune activation relevant to inflammatory disease modeling. This confocal microscopy approach enables target de-risking by linking stimulus exposure to quantifiable chromatin release and protease co-expression. The method supports early discovery workflows where understanding macrophage-driven pathology informs target validation and phenotypic screening strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage activation states through direct visualization of extracellular chromatin and co-expressed mediators like citrullinated histones and granule proteases.
- Operational Value: Provides a reproducible imaging-based assay to compare stimulated versus unstimulated conditions for target pathway modulation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing in inflammation models by correlating MET formation with functional immune responses to infection or stimuli.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable imaging outputs (e.g., chromatin release, H3Cit, protease co-localization) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Includes built-in controls (background, isotype, unstimulated) to ensure assay specificity and reduce false-positive signals in compound evaluation.
- Scalability: Compatible with both in vitro cell culture and ex vivo lung tissue sections, enabling cross-model consistency in target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models macrophage-driven processes in lung inflammation, aligning with preclinical studies of fibrotic, infectious, or autoimmune lung conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo lung tissue analysis, supporting biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective assessment of macrophage extracellular trap formation as a functional readout for go/no-go criteria in immunomodulator screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where MET visualization serves as a functional immune response assay in inflammation-focused programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing chromatin extrusion and protease release as downstream consequences of target modulation in macrophages.
- Screening: Enables quantitative imaging readouts that can be automated via image analysis software to assess compound effects on MET formation across dose ranges.
- Analytics: Delivers multiparametric data (chromatin, citrullinated histones, protease co-expression) enabling statistical comparison of experimental groups for target prioritization.
- Translational Research: Facilitates cross-species comparison (human and mouse lung macrophages) and ex vivo tissue validation, strengthening preclinical-to-clinical translatability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple inflammatory targets and disease models beyond initial validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in macrophage activation studies by providing direct, visual evidence of extracellular trap formation and molecular co-expression.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, staining, and imaging workflows, improving inter-lab reproducibility and data consistency in immune profiling.
- Strategic Value: Informs early portfolio decisions by linking target inhibition to measurable reductions in pathogenic MET formation, decreasing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of immunomodulatory candidates based on functional macrophage phenotype modulation rather than binding affinity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy operation, and image analysis for accurate MET detection and quantification.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate objectives (e.g., 20X air, 40X oil) and laser lines for multichannel fluorescence detection.
- Necessitates standardized antibody panels and titration protocols to ensure specific detection of chromatin, citrullinated histones, and granule proteases across sample types.
- Involves optimization steps for antigen retrieval in FFPE lung tissue, including pressure-based retrieval in Tris-EDTA pH 9.0, to maintain epitope accessibility.
- Limited by the need for careful wash steps to preserve delicate extracellular trap structures during staining, as aggressive handling may disrupt NET/MET morphology.
