تصوير C. ايليجانس عالي الدقة عبر جميع مراحل اليرقات

في المختبر نعمل على جميع أنواع أسئلة علم الأحياء التنموي. أنا أعمل أكثر على الجانب التقني ، وأطور طرقا لمعالجة هذه الأسئلة بشكل أفضل باستخدام تقنيات التصوير. اعتمد مجال C. elegans بنجاح مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأساليب ، بدءا من تحرير الجينات CRISPR ، والنسخ والبروتينات ، وصولا إلى الفحص المجهري فائق الدقة. C. ايليجانس هو نموذج مذهل ، ومع ذلك ، في سياق المراقبة في الجسم الحي بدقة عالية ، فإنه يأتي مع تحدياته ، مما يتطلب الشلل للحصول على أفضل دقة ، مما يحد بدوره من بقاء. يقدم البروتوكول أحد الحلول الممكنة لتصوير C. ايليجانس على المدى الطويل ، مما يسمح للباحثين باعتماد الطريقة في مختبرهم الخاص ودراسة مجموعة متنوعة من العمليات التنموية الديناميكية مباشرة في الجسم الحي. داخل المختبر ، سمحت الطريقة بمراقبة مفصلة لتكوين الأعضاء ، على سبيل المثال ، في سياق التشكل أو اتباع انقسامات الخلايا الجسدية إلى مرحلة البلوغ. تم اعتماد هذه الطريقة منذ ذلك الحين من قبل العديد من المختبرات التي تدرس مجموعة متنوعة من العمليات التنموية.

[مقدم العرض] للبدء ، قم بتوصيل الجهاز بإطار الدعم وقم بتثبيته على المجهر الرأسي. املأ حقنة بالماء منزوع الأيونات ، ثم قم بإرفاق إبرة قياس 23 وقطعة طويلة من أنبوب واحد × 16 بوصة بدبوس فولاذي مثني مجوف. املأ الأنبوب بالماء منزوع الأيونات من المحقنة وأدخل الدبوس الفولاذي في الفتحة المثقوبة لمدخل الصمام لتوصيل الأنبوب. قم بإزالة المحقنة والإبرة قبل ربط الأنبوب بالملف اللولبي خارج الرقاقة. باستخدام برنامج التصوير، قم بتشغيل الملف اللولبي واضغط على الجهاز لعدة دقائق لطرد كل الهواء من الصمام. تحقق من الإكمال عن طريق التحقق بصريا من ظهور واجهة الهواء المائية مظلمة واختفائها في مادة PDMS. قم بإيقاف تشغيل الملف اللولبي باستخدام برنامج التصوير. بعد ذلك ، املأ حقنة سعة مليلتر واحد بمحلول البكتيريا المفلترة وقم بإرفاق إبرة قياس 30 وقطعة طويلة من أنبوب واحد × 32 بوصة بالإبرة. اضغط على المكبس لملء كل من الإبرة والأنبوب المرفق بمحلول البكتيريا. ثم باستخدام الملقط ، أدخل الأنبوب مقاس 32 بوصة مباشرة في مدخل الطعام لجهاز الموائع الدقيقة وضع المحقنة على مضخة المحقنة. اضغط على مكبس المحقنة باستخدام المسمار اللولبي في الخلف لملء الجهاز بالسائل. قم بسد كل من مدخل ومخرج الدودة بدبابيس فولاذية محكمة الغلق وقم بالضغط الإضافي باستخدام برغي التثبيت لإزالة أي هواء متبقي من الجهاز. ثم قم بإزالة الدبوس الفولاذي المسدود في المخرج وقم بتوصيل حاوية النفايات بالمخرج. ادفع المحقنة للتأكد من توصيل حاوية النفايات بشكل صحيح وعدم وجود عوائق في النظام. قم بإزالة الدبوس الفولاذي الثاني المسدود من المدخل وادفع المحقنة حتى تظهر قطرة صغيرة من السائل عند مدخل الدودة. ثم باستخدام إبرة قياس 23 ، قم بإرفاق قطعة أطول من أنبوب واحد × 16 بوصة بقياس حوالي 15 إلى 20 سم بحقنة سعة مليلتر واحد مملوءة بمخزن مؤقت S-basal. قم بتوصيل دبوس فولاذي مستقيم عيار 23 بالطرف الآخر من الأنبوب. املأ الإبرة والأنبوب بمخزن مؤقت S-basal من المحقنة. الآن ، أدخل الدبوس الفولاذي في نهاية الأنبوب في الأنبوب الذي يحتوي على الديدان ، وادفع كمية صغيرة من السائل عبر الأنبوب لضمان عدم ترك الهواء. اسحب الديدان إلى الأنبوب دون سحبها إلى المحقنة. ثم ادفع المحقنة المتصلة بالديدان حتى تظهر قطرة صغيرة من السائل على الدبوس الفولاذي وأدخل الدبوس الفولاذي في مدخل الدودة لجهاز الموائع الدقيقة. ضع الجهاز على مجهر بتكبير منخفض ، إما 5x أو 10x ، أو على مجهر تشريح. ضع الجهاز بحيث يكون المدخل مرئيا على جانب واحد من مجال الرؤية ويكون الجزء الخلفي من مدخل قناة التراكب اللوني مرئيا على الجانب الآخر. ادفع برفق على مكبس حقنة الدودة. بعد ذلك ، ادفع نحو مصفوفة القنوات. بمجرد أن يواجه القناة ، ادفعها إلى القناة وكرر ذلك لحيوانات إضافية. بعد محاصرة عدد كاف من ، ضع المحقنة ، التي لا تزال متصلة بمدخل الدودة على مرحلة المجهر حيث ستبقى طوال التجربة. إذا تم إجراء التحميل على مجهر التشريح ، فقم بنقل الجهاز إلى مجهر التصوير. الآن ، قم بتشغيل مضخة الحقنة وقم بتشغيلها بمعدل محدد مسبقا يبلغ ميكرولتر واحد في الساعة مقابل 0.5 ميكرولتر. قم ببرمجة مضخة الحقنة بحيث تعمل بسرعة ميكرولتر واحد في الساعة ل 0.5 ميكرولتر ، وبعد ذلك يزداد معدل التدفق بمقدار 100 ميكرولتر في الساعة مقابل 0.5 ميكرولتر ، ويتكرر نمط التدفق طوال التجربة. ضع الجهاز على مرحلة المجهر وتأكد من إمساكه بإحكام. قم بالتبديل إلى تكبير التصوير المطلوب. تحديد والمناطق ذات الأهمية داخل مصفوفة قناة المصيدة وإعداد ظروف التصوير المطلوبة. الصورة في ظروف التصوير المرغوبة ، وتشغيل الصمام الموجود على الرقاقة من خلال الملف اللولبي قبل 10 ثوان من الحصول على الصورة بحيث يتم تثبيت في مكانها. حافظ جهاز الموائع الدقيقة على جودة تصوير عالية عبر طرق الفحص المجهري المختلفة ، بما في ذلك المجال الساطع ، والتألق العرضي ، وأقراص الغزل ، وطرق الدقة الفائقة بسبب استخدام زجاج غطاء بسمك 170 ميكرومتر. تطور الخلايا الظهارية Caenorhabditis elegans التي تم تصورها من أوائل L1 إلى منتصف مرحلة اليرقات L2. كان تحريض خلايا سلائف الفرج الباهتة الأولية وانقساماتها اللاحقة من أواخر L1 إلى مرحلة اليرقات L4 المبكرة واضحا. مراحل تكوين الفرج من أوائل L3 إلى مرحلة البلوغ. تم تحسين الصور المكتسبة من خلال فك الالتفاف والتسجيل للصور ، مما أدى إلى تحسين الوضوح البصري حدثت انقسامات الخلايا المرئية بطريقة متسقة وفي الوقت المناسب عبر جميع مع اكتمال جميع الأقسام خلال فترات مرحلة اليرقات النموذجية. زاد طول الغدد التناسلية بشكل مطرد خلال مرحلتي L2 و L3 مع قياسات متسقة تم تمكينها من خلال الاتجاه المستقيم للحيوانات.