جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد عضيات من النوع الأمامي موحدة للغاية وقابلة للتكرار من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. هذه الطريقة هي أداة قوية لنمذجة آليات NTZs الجديدة للتطوير. على وجه الخصوص ، يمكن أن يساعد في معالجة الأسئلة الرئيسية المرتبطة بالتكوين القشري البشري المبكر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتوليد موحد وفعال من الوقت للأنسجة القشرية البشرية مع اختلافات طفيفة بين العضيات الفردية والدفعات العضوية. يمكن أن توفر التكنولوجيا العضوية نظرة ثاقبة لتطور الدماغ البشري وبنيته ووظيفته ، خاصة بالنسبة لتلك الجوانب غير الموجودة في نماذج دماغ الأنواع الأدنى. لتوليد مجاميع الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، عندما تصل مزارع الخلايا الجذعية إلى 70 إلى 90٪ من التقاء ، أضف 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا إلى بئر واحد من لوحة زراعة الآبار الستة لفصل الخلايا.

الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، والتي تتكيف مع ظروف زراعة أحادية الطبقة ، هي نوع جيد من الخلايا لتوليد الركام لأنها أقل عرضة لموت الخلايا الناجم عن الإجهاد أثناء إجراء التفكك والتجميع. بعد خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، اضغط برفق على الطبق ، واستخدم ملليلترين من DMEM / F-12 لغسل الخلايا من قاع البئر. انقل معلق الخلية الناتج إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، وارفع حجم محلول الخلية إلى 10 ملليلتر مع المزيد من وسط DMEM / F-12.

بعد العد ، انقل 4.5 في 10 إلى الخلايا الثالثة لكل تجمع للخلايا الجذعية متعددة القدرات في أنبوب جديد سعة 15 مليلتر ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. نقوم بتعليق الحبيبات في الحجم المناسب من وسط الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، مع استكمال 50 مثبط صخور ميكرومولار لتحقيق 4.5 أضعاف 10 إلى الخلايا الثالثة لكل 150 ميكرولتر من التركيز المتوسط. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من الخلايا إلى الآبار الفردية للوحة منخفضة التوصيل على شكل حرف U ذات 96 بئرا ، وضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لمراقبة تحريض الأديم العصبي الأمامي ، استخدم مجهر زراعة الأنسجة لمراقبة التغيرات المورفولوجية لمجاميع الخلايا الجذعية متعددة القدرات عن كثب كل يوم تحت تكبير منخفض. في اليوم الأول ، يجب مراعاة مجاميع الخلايا ذات الحدود الواضحة. في اليوم الثاني ، قم بسحب ما يقرب من ثلثي الوسط بعناية ، دون إزعاج مجاميع الخلايا في قاع كل بئر ، واستبدل الوسط المهمل ب 100 ميكرولتر من وسط الخلايا الجذعية الطازجة متعددة القدرات.

بعد ما بين أربعة وستة أيام ، عندما يصل قطر مجاميع الخلايا إلى 350 إلى 450 ميكرومتر ، وتظهر حواف ناعمة ، استخدم طرف ماصة معدل سعة 100 ميكرولتر لنقل ما يصل إلى 20 ركاما إلى لوحة ثقافة واحدة منخفضة التعلق يبلغ طولها ستة سنتيمترات تحتوي على خمسة ملليلتر من وسط الحث القشري. استبدل وسط الحث القشري بوسط جديد مرة كل ثلاثة أيام ، ومراقبة مورفولوجيا الركام يوميا تحت هدف 4X. بعد أربعة إلى خمسة أيام في وسط الحث القشري ، يجب أن تبدأ حواف مجاميع الخلايا في السطوع على السطح ، مما يشير إلى التمايز الظاهر العصبي ويجب أن يظهر التنظيم الشعاعي للظهارة الكاذبة.

لتضمين مجاميع الأديم الظاهر العصبي في سقالة مصفوفة ، قم بإذابة مستخلص الغشاء القاعدي على الجليد لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. أثناء ذوبان المستخلص ، استخدم مقصا معقما لتقطيع فيلم البارافين البلاستيكي إلى أربعة سنتيمترات مربعة لكل 16 عضوا ، وضع كل قطعة من الفيلم فوق صينية فارغة بحجم 100 ميكرولتر من أطراف الماصة الدقيقة. اضغط على فيلم البارافين بطرف إصبع مرتديا قفازا حتى تظهر غمازات صغيرة ، ونظف الفيلم بنسبة 70٪ من الإيثانول.

بعد الأشعة فوق البنفسجية في خزانة مغلقة ومعقمة للسلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة ، استخدم طرف ماصة معدل سعة 100 ميكرولتر مع فتحة من واحد ونصف إلى ملليمترين لنقل كل خلية مجمعة إلى غمازة واحدة في الفيلم. عندما يتم نقل جميع الركام، استخدم طرف ماصة غير مقطوع سعة 100 ميكرولتر لشفط الوسط بعناية من كل غمازة، وأضف 40 ميكرولترا من مستخلص الغشاء القاعدي غير المخفف إلى كل مجموعة خلية. احرص على عدم إتلاف العضيات عن طريق التلاعب الخشن أو الشفط في طرف الماصة لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف الظهارة العصبية النامية.

استخدم طرف الماصة لوضع الركام في منتصف كل قطرة، واستخدم ملقطا معقما لنقل لوح فيلم البارافين البلاستيكي بعناية إلى طبق بتري بطول 10 سم. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. أثناء تصلب المستخلص ، أضف خمسة ملليمترات من وسط الحث القشري الطازج إلى طبق ثقافة منخفض التعلق يبلغ طوله ستة سنتيمترات.

في نهاية الحضانة ، اقلب ورقة فيلم البارافين واستخدم ملقطا معقما للضغط برفق على ما يصل إلى 16 قطرة مبلمرة في كل طبق يبلغ طوله ستة سنتيمترات. ثم أعد الركام إلى حاضنة زراعة الخلايا. في اليوم التالي ، انقل أطباق الثقافة العضوية إلى شاكر ثقافة الخلايا الهزازة ، مائلة بزاوية خمس درجات عند 14 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الخلايا ، مع مراقبة المجهر الضوئي اليومي ، حتى تصل الركام إلى مرحلة التمايز ذات الاهتمام.

في اليوم 20، استخدم طرف ماصة معدل سعة مليلتر واحد مع فتحة من ثلاثة إلى ثلاثة مليلتر ونصف لجمع ستة عضيات من المزارع الإجمالية. ضع ثلاثة من العضيات في بئر واحد من صفيحة 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من PBS ، واستخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لغسل العضيات مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS الطازج لكل غسلة. بعد الغسيل الثاني ، قم بتثبيت العضيات في بارد 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة ، تليها ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة PBS ، وتجفيف نهائي بين عشية وضحاها في محلول سكروز 30٪ عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بتلطيخ العضيات المجففة مسبقا بتخفيف من واحد إلى 50 تريبان بلو لمدة 10 دقائق للسماح بتصور العضيات أثناء إجراء التقطيع بالتبريد ، واستبدل السكروز بوسط تضمين طازج. قم بتسخين اللوحة على وسادة تسخين 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لموازنة العضيات في وسط التضمين ، وقم بتغطية الجزء السفلي من قالب تضمين واحد لكل عضوي بوسط تضمين جديد. ضع القالب على الجليد لترسيخ وسط التضمين ، وانقل العضيات إلى قوالب التضمين ، وأضف وسيط تضمين جديد حتى يتم تغطية كل عضوية.

ثم قم بتجميد العضيات بالصدمة في حمام تجميد الثلج الجاف بنسبة 100٪ من الإيثانول لمدة دقيقة واحدة على الأقل ، واستخدم ناظم البرد للحصول على أقسام بسمك 20 ميكرومتر من كل مادة عضوية للتحليل الكيميائي المناعي. لتوليد عضيات من نوع الدماغ الأمامي ، استخدم فقط ثقافات IPSC التي تظهر كطبقة أحادية متجانسة من الخلايا غير المتمايزة في السكان المبتدئين. في اليوم الثاني ، يجب أن تكون الركام قد شكلت براعم خلوية مدمجة ذات حواف ناعمة.

يجب أن تظهر مجاميع اليوم 10 نسيجا ناعما وناعما بصريا وشفافا بصريا على السطح الخارجي ، مما يمثل تحريض الأديم الظاهر العصبي. إذا تم اتباع البروتوكول عن كثب ، إنشاء دفعات عضوية موحدة للغاية تظهر تجانس أكبر من أو يساوي 90٪ في تكوين الأديم الظاهر العصبي المستقطب داخل الدفعات وعبرها. يكشف التحليل الكيميائي المناعي للعضيات في اليوم 20 عن حلقات ظهارية عصبية طبقية تعبر عن علامة الخلايا الجذعية العصبية Sox2 ، وعلامات الدماغ الأمامية Pax6 و Otx2 ، والعلامة القشرية الظهرية Emx1.

تتميز هذه الحلقات القشرية أيضا بالتوطين القمي ل N-cadherin و ZO-1 ، والأنابيب الدقيقة المشتقة من الخلايا الدبقية الشعاعية في المنطقة البطينية ، والتي تمتد من الجانب القمي إلى الجانب القاعدي من الهياكل ، والخلايا المنقسمة القمية التي تلطخ إيجابية للفيمنتين الفسفري. لتحليل مستوى الانقسام للخلايا الدبقية القمية الشعاعية ، تلطيخ مزدوج للفيمنتين و Tpx2 ، يمكن إجراء بروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة يمكن استخدامه لتصور المغزل الانقسامي والعمليات القمية أثناء الهجرة النووية بين الحركة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد عضيات من نوع الدماغ الأمامي عالية الوحدة ومتجانسة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

تسهل هذه التقنية دراسة الجوانب الخاصة بالإنسان لاضطرابات النمو العصبي باستخدام نموذج خلية ثلاثي الأبعاد معقد مرتبة بطريقة خاصة بالأنسجة العصبية. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن استخدام هذه العضيات القشرية لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، مثل دراسات النمو العصبي أو التطوري أو وظائف الجينات ، بما في ذلك نمذجة المرض وربما اختبار الأدوية أو العلاج.