كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحرير الجينوم المستهدف باستخدام تقنية CRISPR / Cas9 في أسماك الزرد لهندسة الضربة القاضية الجينية بطريقة قوية وغير مكلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الدور البيولوجي للجين في سياق نظام نموذج الفقاريات مثل كيفية مساهمة الجين في العمليات التنموية في حقيقيات النوى ذات الترتيب الأعلى. من خلال هذه الإجراءات القوية البسيطة ، يمكن لموظفي المختبر من جميع مستويات الخبرة بما في ذلك الطلاب الجامعيين إجراء تعديلات جينومية مستهدفة في أسماك الزرد.

يجب أن يكون الأفراد الجدد في هذه الطريقة قادرين على اتباع التعليمات خطوة بخطوة لتحديد الأهداف الجينومية المثلى للطفرات CRISPR ، وإجراء الحقن المجهري لجنين الزرد وتحديد الأليلات المعدلة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن هذه الطريقة مخصصة للطلاب الجامعيين الذين قد لا يكونون على دراية بواحدة أو أكثر من التقنيات اللازمة. يتم توفير إرشادات لتصميم oligos الخاصة بالقالب لإنتاج الحمض النووي الريبي الإرشادي في بروتوكول النص.

للبدء ، قم بتعليق بروتين Cas9 في المخزن المؤقت لتوليد محلول واحد ملليغرام لكل مليلتر. قم بتخزين هذا المحلول في حصص جاهزة للحقن عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامه لاحقا. ثم قم بتجميع sgRNA باستخدام مجموعة نسخ في المختبر مثل تلك المقترحة في مواد هذه المقالة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتنقية sgRNA المركب باستخدام ترسيب أسيتات الأمونيوم الخالي من RNAse. أضف 25 ميكرولترا من أسيتات الأمونيوم الخمسة مولارية إلى الحمض النووي الريبي المركب واخلط المحلول عن طريق الدوامة. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من الإيثانول الخالي من النوكلياز 200 إلى العينة.

وضع التفاعل في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات بأقصى سرعة. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الحمض النووي الريبي.

ثم أضف ملليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول واقلب الأنبوب عدة مرات لغسل الملح المتبقي من الأنبوب. جهاز طرد مركزي مرة أخرى بأقصى سرعة عند أربع درجات مئوية لمدة سبع دقائق. استخدم ماصة P1000 لإزالة معظم المحلول.

بعد ذلك ، استخدم ماصة P200 لإزالة أكبر قدر من المحلول المتبقي دون إزعاج الحبيبات. مع الحرص على تجنب تلوث الحمض النووي الريبي ، جفف الحبيبات في مكان نظيف حتى لا تظهر قطرات سائلة في الأنبوب. أعد تعليق الحبيبات في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي واستخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد كمية المنتج.

Aliquot الحل للتخزين طويل الأجل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، امزج 300 إلى 500 نانوجرام من sgRNA بحجم متساو من صبغة تحميل هلام الحمض النووي الريبي 2X. بعد ذلك ، باستخدام ماصة P1000 ، قم بتنظيف كل آبار من آبار هلام الاغاروز من الحطام باستخدام عازلة قيد التشغيل عدة مرات.

قم بتحميل المحاليل في آبار هلام الاغاروز وقم بتشغيل الجل بجهد 10 فولت لكل سنتيمتر لفترة كافية لفصل نطاقات الحمض النووي الريبي على الجل. قد يختلف الوقت حسب جهاز الرحلان الكهربائي. بشكل عام ، يجب تشغيل مقدمة الصبغة إلى 2/3 ثانية من طول الجل.

ثم استخدم بقعة الحمض النووي لتصور العصابات. يظهر الحمض النووي الريبي السليم كنطاق واحد كما هو الحال في الممر الأول والثاني الموضح هنا. يعمل الحمض النووي الريبي المتدهور كمسحة كما هو الحال في الممر الثالث.

أولا ، قم بإعداد الأشخاص الذين يستخدمون أسماك الزرد للتكاثر في الليلة السابقة لإجراء الحقن كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم امزج بين بروتين Cas9 و sgRNA بنسبة اثنين إلى واحد. احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق بينما يشكل Cas9 و sgRNA مركبا من البروتين النووي الريبي.

ثم أضف 0.5 ميكرولتر من محاليل الفينول الحمراء بنسبة 2.5٪ في ماء خال من RNAse كاف لتحقيق حجم نهائي يبلغ خمسة ميكرولترات. لتحضير إبرة الحقن، استخدم مجتذب ماصة دقيقة لسحب شعرية زجاجية بحجم ملليمتر واحد. ثم قم بقص طرف الإبرة الزجاجية الناتجة بشفرة حلاقة للحصول على فتحة بزاوية.

ضع الإبرة في جهاز معالج دقيق متصل بحاقن دقيق. باستخدام مجهر ضوئي ، اضبط ضغط الحقن حتى تقوم الإبرة بحقن نانومتر واحد من المحلول باستمرار في طبق بتري. قبل إجراء الحقن المجهري للجنين ، تدرب على تحضير الإبر وحقن أجنة التحكم باستخدام محلول صبغي فقط وسجل البقاء على قيد الحياة بعد 24 ساعة من النمو.

يجب أن تكون قادرا على الحصول على بقاء أكبر من 90٪ مقارنة بعنصر تحكم غير محقون. بعد ذلك ، حدد من 10 إلى 15 جنينا كمجموعة تحكم وضعها في طبق بتري منفصل يحمل علامة تجارية. باستخدام ماصة النقل ، قم بتبطين الأجنة المتبقية بحذر على لوحة حقن بدرجة حرارة الغرفة.

تحت مجهر التشريح ، قم بحقن نانولتر واحد من المحلول في كيس صفار البيض في كل جنين. ثم أعد الأجنة المحقونة إلى طبق بتري المسمى وقم بتغطيتها بوسائط 1X E3 باللون الأزرق الميثيلين. ضع الأجنة المحقونة في حاضنة على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

ثم افحص الأجنة المحقونة لإزالة الأفراد الموتى أو الذين يتطورون بشكل غير طبيعي. أولا ، اجمع مجموعتين من خمسة أجنة عمرها 72 ساعة من الصفائح التي تحتوي على أجنة محقونة ومجموعة واحدة من خمسة أجنة عمرها 72 ساعة من مجموعة التحكم غير المحقونة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. قم بإزالة الوسائط برفق من كل مجموعة جنين وتخديرها.

قم بإزالة المخدر بعد دقيقتين وأضف 45 ميكرولتر من 50 مللي مولار هيدروكسيد الصوديوم. ثم احتضان العينات عند 95 درجة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة العينات من الحاضنة واتركها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

أضف خمسة ميكرولترات من هيدروكلوريد الأس الهيدروكلوريد المولي الواحد وقم بدوامة العينات بقوة. ثم الطرد المركزي المحلول بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الجيني إلى أنبوب جديد مسمى وقم بتخزين الحمض النووي الجافي عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

استخدم الاشعال المصممة للتضخيم حول المنطقة المستهدفة sgRNA كما هو موضح في النص لتضخيم جزء PCR لتحليل heteroduplex. استخدم مجموعة تنظيف PCR لتنقية منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). خفف العينات في 30 ميكرولترا من الماء واستخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد الحمض النووي.

ضع الأنابيب التي تحتوي على أمبليكونات PCR في رف عائم في حمام ماء مغلي. بعد ذلك ، قم بإعداد جل بولي أكريلاميد TBE بنسبة 15٪ باستخدام 30٪ بولي أكريلاميد. بعد أن يتماسك الهلام ، ضعه في جهاز الرحلان الكهربائي مع عازلة تشغيل TBE.

ثم قم بتحميل 500 نانوجرام من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المعاد صلبتها وقم بتحميل عنصر تحكم بجوار كل مجموعة من عينات sgRNA. قم بتشغيل الجل على حرارة 150 فولت لمدة ساعتين ونصف أو حتى تصبح مقدمة الصبغة في قاع الجل. يكبر أجنة أسماك الزرد المحقونة حتى مرحلة البلوغ التي تظهر نطاقات غير متجانسة في HMA.

لتفسير HMA ، قارن شدة النطاق المتماثل من تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحكم غير المحقون من النوع البري بالعينات المحقونة المقابلة. في حالة حدوث قطع كاف ، يجب أن تكون شدة الشريط من الأسماك المحقونة أقل بنسبة 50٪ تقريبا من التحكم في النوع البري. لتأكيد وجود indels في الأسماك الأم المؤسس المحتمل ، قم بتخدير الأسماك بنسبة 0.004٪ tricaine واستخدم شفرة حلاقة نظيفة لإزالة 1/2 إلى 3/4 من زعنفة الذيل.

ثم ضع الذيل في 45 ميكرولتر من 50 مللي مولار هيدروكسيد الصوديوم. أعد السمكة إلى خزان الاسترداد وقم بإجراء استخراج gDNA كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، قم بإجراء HMA على مشبك الذيل gDNA لتحديد ما إذا كان الفرد قد تم تعديله بنجاح عن طريق حقن كريسبر.

ثم قم بتربية البالغين الذين يظهرون نطاقات غير متجانسة في الحمض النووي للذيل إلى الأسماك البرية. حدد سمكة المؤسس لتوليد أسماك F1 بناء على تحليل HMA لأحواض السباحة. أخيرا ، تسلسل gDNA للأسماك ذات الأهمية لتوصيف طبيعة indel.

بعد الإنتاج الناجح والحقن المجهري لكواشف كريسبر ، تم تحليل أجنة أسماك الزرد بحثا عن الأنماط الظاهرية العلنية وتكوين إندل باستخدام HMA. يؤدي تكوين إندل المستحث عن Cas9 في التيروزيناز إلى فقدان التصبغ ويتم تسجيله بسهولة بعد 48 ساعة من الإخصاب. يتم تحديد الأليلات المعدلة بتقنية كريسبر التي لا تؤدي إلى أنماط ظاهرية تنموية علنية باستخدام HMA.

الاستهداف الناجح للجين محل الاهتمام إلى تكوين نطاقات غير متجانسة مزدوجة وتقليل شدة النطاق المتماثل مثل الممرات الثالثة والرابعة. لا تنس أن العمل مع كائن فقاري يحمل مسؤوليات أخلاقية. يصف هذا البروتوكول الاستراتيجيات التي تقلل من عدد أسماك الزرد اللازمة للحصول على ضربة قاضية ، وهو هدف يجب أخذه في الاعتبار أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لتوليد وتحديد أسماك الزرد التي تحمل أليلات معدلة من CRISPR والتي ستنتقل في السلالة الجرثومية بكفاءة عالية. الأهم من ذلك ، تم تحسين هذه التقنية لتكون نهجا منخفض التكلفة متاحا للطلاب الجامعيين وغيرهم ممن لديهم خبرة سابقة قليلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وتنفيذ نهج خروج المغلوب الجيني القائم على كريسبر بسهولة باستخدام سمك الزرد.