الأسلوب الكمي والنوعي سفينجوميلين من LC-MS استخدام اثنين مستقرة نظير المسمى الأنواع سفينجوميلين

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحليل الدقيق لكمية وهيكل كل نوع من أنواع Sphingomyelin في العينات البيولوجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الدهون المتعلقة ببيولوجيا الدهون والدهون الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا توصيف مجموعة متنوعة من أنواع Sphingomyelin في العينات البيولوجية عن طريق نظام قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا. للبدء ، قم بإزالة وسائط الثقافة من طبق زراعة الأنسجة الذي يبلغ طوله 10 سم والذي يحتوي على خلايا HeLa واشطف الخلايا مرتين بستة ملليلتر من PBS المثلج.

ثم أضف ملليلترا واحدا من PBS المثلج البارد إلى طبق زراعة الأنسجة الذي يبلغ طوله 10 سم واستخدم مكشطة الخلايا لحصاد الخلايا. بمجرد إزالتها من سطح الطبق ، انقل الخلايا إلى أنبوبين بلاستيكيين من السيليكون. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف مليلتر واحد من الميثانول إلى كل حبيبات خلية.

ثم دوامة الأنابيب لفترة وجيزة. بعد ذلك ، ضع العينات في جهاز صوتي من نوع الحمام وصوتنة عند 200 واط لمدة خمس دقائق. عند الانتهاء ، انقل تجانس الخلية بأكملها إلى أنابيب اختبار مجهزة بأغطية لولبية مبطنة بالتفلون.

أضف الآن ملليلترا واحدا من الميثانول ، ومليلتر واحد من الكلوروفورم ، و 0.8 مل من الماء المقطر المزدوج في 50 ميكرولتر من 10 ميكرومولار من معيار داخلي في كل أنبوب اختبار. قم بتغطية الأنابيب وقم بدوامها بقوة عند 2 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف ملليلترا إضافيا من الكلوروفورم ومليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج إلى كل أنبوب.

مرة أخرى ، قم بدوامة الأنابيب بقوة عند 2 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات من أجل فصل المراحل المائية والعضوية تماما. انقل المرحلة السفلية إلى أنابيب زجاجية يمكن التخلص منها.

أضف ملليلترين من الكلوروفورم في أنابيب الاختبار. ثم قم بتدوير الأنابيب بقوة عند 2 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتختلط بشكل كاف مع المرحلة العليا والزغب بين الأطوار. بعد الطرد المركزي الثاني ، انقل المرحلة السفلية المعدلة إلى الأنابيب الزجاجية التي تستخدم لمرة واحدة جنبا إلى جنب مع المرحلة السفلية الأولية.

الآن ضع الأنابيب الزجاجية تحت تيار النيتروجين لمدة 60 دقيقة تقريبا وقم بإزالة المذيبات العضوية تماما في المرحلة السفلية المجمعة. أخيرا ، أعد تكوين العينات ب 500 ميكرولتر من الميثانول أو الإيثانول. قم بتصفية الخليط الناتج بفلتر 0.02 ميكرون في قوارير زجاجية.

ثم قم بتخزين العينة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإجراء عمليات تخفيف تسلسلية للمركب القياسي وأضف 50 ميكرولترا من كل تركيز في أنابيب اختبار منفصلة. بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاث عينات لمراقبة الجودة عن طريق إضافة كمية في حدود ثلاثة أضعاف الحد السفلي للمنحنى القياسي إلى العينة الأولى ، وكمية بالقرب من مركز المنحنى للعينة الثانية ، وكمية بالقرب من الحد العلوي للمنحنى القياسي للعينة الثالثة.

ثم أضف الخلية المتجانسة في ملليلتر واحد من الميثانول في كل أنبوب اختبار واستخرج الكسر الدهني الكلي من كل عينة باستخدام الطريقة الموضحة للتو. للبدء ، قم بإعداد المرحلة المحمولة. اخلطي الأسيتونيتريل والميثانول والماء المقطر المزدوج معا بنسبة اثنين إلى اثنين إلى واحد للمرحلة المائية.

استخدم الأيزوبروبانول للمرحلة العضوية في الزجاجات ذات الأغطية اللولبية المبطنة بالتفلون. ثم صوتنة كلتا المرحلتين المتنقلتين لمدة خمس دقائق في سونيكاتور من نوع الحمام. ثم أضف حمض الفورميك إلى التركيز النهائي البالغ 26.4 مللي مولار وهيدروكسيد الأمونيوم عند 14.9 مللي مولار في كل مرحلة متحركة.

للتحليل النوعي ، قم بتنشيط نظام الكروماتوغرافيا السائلة عالي الأداء. ضع أنابيب المدخل في الزجاجات التي تحتوي على المراحل المتنقلة وقم بتطهير خطوط HPLC. ثم قم بربط عمود C18 HPLC بنظام HPLC.

حافظ على درجة الحرارة في فرن العمود عند 50 درجة مئوية وقم بتكييف العمود بالمرحلة المائية المتحركة عند 100 ميكرولتر في الدقيقة. أثناء التشغيل ، ضع العينات في رف عينة لجهاز أخذ العينات التلقائي. قم بتعيين معلمات نظام قياس الطيف الكتلي لمصيدة الأيونات الخطية الثلاثية الرباعية والرباعية لتحليل قياس الطيف الكتلي ثلاثي المراحل كما هو مذكور في الجدول الأول والجدول الثاني من بروتوكول النص المصاحب.

أيضا ، قم بتعيين معلمات الأيونات السليفة الأولى والثانية لأنواع SM ذات الأهمية كما هو موضح بمزيد من التفصيل في بروتوكول النص المصاحب. قم بإنشاء ملف دفعي وإرسال ملف الدفعة للحصول على بيانات أطياف أيون MS ثلاثة منتجين لكل نوع من أنواع Sphingomyelin عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة ، التأين بالرش الكهربائي ، تحليل الطيف الكتلي الترادفي. احصل على أطياف أيونيات منتج MS ثلاثية الأطوار لأنواع Sphingomyelin ذات الأهمية عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي للتأين بالرش الكهربائي للكروماتوغرافيا السائلة.

ثم قم بتعيين كل أطياف أيونية MS ثلاثة منتجين من Sphingomyelin من خلال مقارنة نسبة الكتلة إلى الشحنة لأطياف الأيونات المنتجة في الكتلة الدقيقة لقاعدة Sphingoid طويلة السلسلة وجزء n-acyl ذي الأهمية. تحليل Sphingomyelin كميا باستخدام تحليل الطيف الكتلي الترادفي للتأين بالرش الكهربائي للكولوماتوغرافيا السائلة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ثم قم بمعالجة بيانات مراقبة التفاعل المتعدد باستخدام البرنامج لتكامل البيانات للحصول على بيانات منطقة الذروة للكروماتوجرام الأيوني المستخرج لكل نوع من أنواع Sphingomyelin.

حدد كل نوع من أنواع Sphingomyelin وقم ببناء المنحنيات القياسية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. يظهر هنا طيف كل من Sphingomyelin و Sphingomyelin المركب كيميائيا في عينات الدهون المستخرجة من خلايا HeLa. وتجدر الإشارة إلى أن شدة طيف sphingosylphosphorylcholine منزوعة الميثيل أكبر من تلك الموجودة في جزء SM n-acyl في كلتا العينتين.

ومن المثير للاهتمام أيضا أن الطيف المقابل لسفينجوسين -1-فوسفات مفيد للتكهن بعدد الكربون والروابط المزدوجة لقاعدة السلسلة الطويلة للاسفينجوميلين. في الطريقة الكمية الحالية ، من الأهمية بمكان إعداد عينات بدقة لبناء منحنى المعايرة في التحقق من صحة هذه الطريقة. تم تحسين المنحنى المناسب للتركيز المنخفض بوضوح باستخدام عامل الترجيح يساوي واحدا على x تربيع مقارنة بعامل الترجيح واحد أو واحد على x.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء والصناعة لتوصيف مجموعة متنوعة من أنواع Sphingomyelin في العينات البيولوجية ومنتجات الصناعة مثل مستحضرات التجميل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل كمية وهيكل كل نوع من أنواع Sphingomyelin بدقة في العينات البيولوجية. لا تنس أن العمل مع المواد الماصة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام الملابس الزجاجية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ارتداء القفازات لمنع تلوث الدهون المشتقة من يديك.