تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إجراء تغييرات جينومية مستهدفة في مجموعة متنوعة من الخلايا والكائنات الحية باستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي CRISPR / Cas9. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة البيولوجية الأساسية من خلال منح الباحثين القدرة على إنشاء عمليات إدراج وحذف واستبدال مصممة خصيصا في جينومات غير معدلة للكائنات الحية النموذجية وغير النموذجية. الميزة الرئيسية لاستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي أو RNP بدلا من الحمض النووي البلازميد هي أن الكفاءة أعلى ، ويتم تقليل الأحداث غير المستهدفة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاجات خارج الجسم الحي لمحاربة أشياء مثل السرطان أو فيروس نقص المناعة البشرية أو الأمراض الوراثية. وذلك لأنه يمكن استخدام تحرير الجينوم لتصحيح الطفرات الضارة أو حتى تعزيز قدرة الخلايا على محاربة الأمراض الضارة. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى حول الخلايا البشرية الأولية ، C.elegans ، و Parhyale hawaiensis.

يمكن تطبيقه لإجراء تغييرات جينية في مئات الأنظمة الأخرى بما في ذلك الكائنات الحية المستعصية سابقا. ابدأ هذا الإجراء بتصميم وإعداد دليل الحمض النووي الريبي كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتجميع مركب RNP عن طريق خلط كمية مولية من مرة إلى مرتين من الحمض النووي الريبي الإرشادي مع 200 بيكومول من بروتين Cas9 بحجم إجمالي قدره 10 ميكرولترات.

ببطء شديد ، أضف Cas9 المركز إلى الحمض النووي الريبي الإرشادي لمدة 30 ثانية تقريبا ، مما يجعل دوائر سريعة باستخدام الماصة. رفع تركيز Cas9 النهائي إلى 20 ميكرومولار. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من RNP إلى كل بئر كوفيت.

بعد تحضير HSPCs كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بحساب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وانقل 150،000 إلى 200،000 خلية لكل كوفيت ليتم تكوينها كهربائيا إلى أنبوب طرد مركزي. قم بتدوير الأنبوب بقوة 100 مرة من الجاذبية لمدة 10 دقائق لتكسير الخلايا. شفط المادة الطافية بماصة أو فراغ ، وإزالة أي فقاعات.

أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي لكل بئر كوفيت. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من الخلايا التي تحتوي على 150،000 إلى 200،000 HSPCs إلى كل بئر كوفيت تمتلك بالفعل 10 ميكرولتر من RNP وتخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل دون تكوين فقاعات. أخيرا ، قم بتكليف الكوفيتات بعد وضعها في Nucleofector.

بالنسبة إلى HSPCs ، استخدم رمز النبض ER-100. ابدأ بإعداد C.elegans في منصات الاغاروز كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع وسادة حقن الاغاروز وقم بتغطية زلة على منظار التشريح.

استخدم معول دودة لوضع مسار صغير من زيت الهالوكربون على طول حافة واحدة من الوسادة. بعد ذلك ، استخدم معول الدودة المطلي بالزيت لرفع العديد من الديدان من صفيحة أجار NG إلى مسار الزيت. مع وجود شعر ناعم متصل بماصة ، مثل رمش أو شعيرات قطة ، ضع الديدان بالتوازي ، وادفع الديدان برفق إلى وسادة الاغاروز.

حتى تشعر بالراحة مع إجراء الحقن المجهري ، قم بتركيب دودة واحدة فقط في كل مرة. بمجرد أن تكون في موضعها وتوصيلها بالوسادة ، قم بتراكب الديدان ببضع قطرات أخرى من زيت الهالوكربون من طرف معول الدودة. ضع زلة الغطاء مع الديدان المثبتة على مجهر الحقن.

تحت تكبير منخفض ، ضع الديدان بشكل عمودي على إبرة الحقن التي تم ملؤها بمحلول RNP ، كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بالتبديل إلى تكبير عال وأعد وضع الإبرة المجاورة لذراع الغدد التناسلية ، المقابلة للمنطقة القريبة من النوى في منتصف إلى أواخر الباشيتين. باستخدام المعالج الدقيق ، حرك الإبرة ضد الدودة ، واضغط على البشرة قليلا.

ثم ، بيد واحدة ، اضغط على جانب مرحلة المجهر لتحريك الإبرة عبر البشرة. اضغط على مجداف الحقن أو الزر ، واملأ ذراع الغدد التناسلية ببطء بمزيج الحقن وقم بإزالة الإبرة. كرر الخطوة مع ذراع الغدد التناسلية الأخرى.

بمجرد حقن الديدان ، قم بإزالة زلة الغطاء ووسادة الاغاروز وضعها تحت مجهر تشريح. باستخدام ماصة شعرية مسحوبة، قم بإزاحة الزيت من الديدان عن طريق سحب عازلة M9 فوقها. قم بإجراء هذا العلاج لتحرير الديدان من الأجار.

بعد 10 دقائق ، عندما تضرب الديدان في المخزن المؤقت ، انقلها إلى صفيحة أجار NG مع بكتيريا OP50 باستخدام الماصة الشعرية المسحوبة. ضع الطبق على حرارة 20 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات حتى تتعافى الديدان وتتحرك. بمجرد التعافي ، انقل الديدان بشكل فردي إلى ألواح أجار NG مع OP50.

ثم انقل الألواح إلى حاضنة 25 درجة مئوية. اجمع أجنة Parhyale أحادية الخلية في صفر إلى أربع ساعات بعد الإخصاب عن طريق تخدير الإناث الحاملات أولا بزيت القرنفل ومياه البحر بنسبة 0.02٪. اكشط الأجنة برفق من كيس الحضنة البطني باستخدام ماصة زجاجية مستديرة ومسحوبة باللهب وزوج باهت من الملقط رقم ثلاثة.

باستخدام النيتروجين المضغوط ، قم بحقن أجنة Parhyale تحت مجهر تشريح باستخدام حاقن دقيق ومعالج دقيق. قم بتحميل 1.5 ميكرولتر من مزيج الحقن في الجزء الخلفي من أنبوب شعري مسحوب باستخدام طرف ماصة اللودر الصغير. بعد وضع الإبرة على جهاز الحقن ، اكسر طرف الإبرة باستخدام زوج من الملقط تحت نطاق التشريح.

قم بمعايرة الحجم الذي تم تسليمه عن طريق حقنه في زيت الهالوكربون 700 وقياس قطر الفقاعة. اقطع الحوض الصغير من عامل المعالجة باستخدام شفرة حلاقة. املأها في منتصفها بمياه البحر المعقمة بالترشيح وقم بتبطين أجنة Parhyale في الحوض الصغير للحقن.

حقن الأجنة باستخدام إعداد الحقن المجهري ، وتثبيت كل جنين بزوج من الملقط أثناء الحقن. بعد الحقن ، استخدم ماصة نقل الزجاج لنقل الأجنة إلى طبق استزراع طازج سعة 60 ملم مملوء في منتصف الطريق بمياه البحر المعقمة بالترشيح قبل تشريح الأجنة وتثبيتها في مراحل مختلفة. اصنع إبر تشريح عن طريق خيوط قطعة مثنية من سلك التنغستن يبلغ طولها حوالي 0.5 بوصة في نهاية إبرة الأنسولين.

استخدم حقنة سعة مليلتر واحد كمقبض لإبرة التشريح وشحذ الإبرة في هيدروكسيد الصوديوم تحت تيار. املأ بئر واحدة من طبق زجاجي بثلاثة آبار في منتصف الطريق بمحلول طازج مكون من تسعة أجزاء من PEM buffer ، وجزء واحد 10X PBS ، وجزء واحد 32٪ PFA. ضع ثلاثة إلى خمسة أجنة في الطبق وقم بعمل ثقب صغير في كل جنين باستخدام إبرة تنجستن حادة للوخز وإبرة باهتة قليلا للاستقرار ، مما يسمح للصفار بالتدفق والمثبت للداخل.

باستخدام زوج من إبر التنغستن الحادة ، قم بإزالة الغشاءين الخارجيين المحيطين بجنين Parhyale برفق. قم بتشريحها في المثبت لجعل الأجنة أكثر قوة ولكن اعمل بسرعة لمنع الغشاء من أن يصبح ثابتا على الجنين ، مما يجعل إزالة الغشاء أكثر صعوبة. اسمح للأجنة بالإصلاح لمدة 15 إلى 20 دقيقة لتلوين الأجسام المضادة ، أو 40 إلى 50 دقيقة للتهجين في الموقع.

في بعض الأحيان ، يتم تقييم نتائج تجربة التحرير بشكل أفضل من خلال اختبار تجريبي. تظهر هنا النتائج التمثيلية لكل من الخلايا التائية من النوع البري وخلايا CD25 التي تضرب القاضية. يظهر قياس التدفق الخلوي أن الخلايا التي لم يتم تحريرها باستخدام Cas9 RNP تعبر عن CD25.

ومع ذلك ، فإن الخلايا التي تم فيها إخراج CD25 لا تعبر عن البروتين. بالنسبة للاضطرابات واسعة النطاق ، قد يكون لنتائج التحرير أنماط ظاهرية بصرية واضحة. على سبيل المثال ، النوع البري Parhyale hawaiensis له بطون طبيعي مع أرجل سباحة ومثبتة.

يؤدي تعطيل جين Abd-B إلى استبدال أرجل السباحة والتثبيت البطنية بأرجل القفز والمشي ، والتي عادة ما ترتبط فقط بالصدر. بالإضافة إلى التحقق من الأنماط الظاهرية ، يجب على المجربين أيضا تحليل النمط الجيني لتقييم كفاءة التحرير الإجمالية واكتشاف التغيرات الجينية المحددة. بالنسبة للنسخ الفردية ، يمكن تحقيق ذلك من خلال تسلسل Sanger البسيط.

في مجموعات مختلطة من الخلايا ، يوصى بتحليل تسلسل أكثر تقدما. على سبيل المثال ، يمكن ل TIDE تعيين جميع indels المختلفة التي حدثت في خلايا فردية داخل تجمع RNP المحرر. عند محاولة هذا الإجراء لأول مرة ، حاول استخدام أحد عناصر التحكم الإيجابية التي قمنا بإدراجها في الجدول الأول.

يمكن أن يساعدك استخدام دليل الحمض النووي الريبي المجرب والحقيقي في التعرف على التحرير باستخدام RNP قبل تصميم تجربتك الخاصة.