مقايسة المستندة إلى بولياكريلاميدي تنسيق متعدد جيدا لدراسة أثر صلابة المصفوفة خارج الخلية على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة

الهدف العام من هذه المنهجية هو تمكين توصيف تأثير تصلب المصفوفة خارج الخلية على العدوى البكتيرية للخلايا الملتصقة بطريقة كمية عالية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الناشئ للميكانيكا الحيوية لمسببات الأمراض المضيفة ، مثل دور القوى الميكانيكية في تعديل قابلية الإصابة بالعدوى البكتيرية للخلايا المضيفة. تساعد هذه التقنية في إنشاء تسلسلات فيديو بفاصل زمني عالي الدقة مع فحص حالات متعددة في نفس الوقت وأتمتة إجراءات معينة.

لإجراء تنشيط الزجاج للأطباق المكونة من 24 بئرا ، أضف 500 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم تومالو لكل بئر قطر 13 ملم واحتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تخلص من هيدروكسيد الصوديوم واستخدم الماء عالي النقاء لشطف الآبار مرة واحدة. ثم أضف 500 ميكرولتر من اثنين في المائة من ثلاثي إيثوكسيسيلان بنسبة 95٪ إلى كل بئر واحتضنها لمدة خمس دقائق.

بالماء ، اشطف الآبار مرة واحدة. ثم أضف 500 ميكرولتر من 0.5٪ جلوتارالديهايد إلى كل بئر واحتضان الأطباق لمدة 30 دقيقة. بعد الشطف مرة واحدة بالماء ، جفف الأطباق على حرارة 60 درجة مئوية مع إغلاق الغطاء.

لتصنيع الهلاميات المائية ذات الصلابة القابلة للضبط ، قم بإعداد محاليل مائية تحتوي على ثلاثة إلى 10 في المائة من محلول أكريلاميد بنسبة 40٪ و 06 إلى 6 في المائة من محلول ثنائي الأكريلاميد بنسبة اثنين في المائة ، اعتمادا على الصلابة المطلوبة للهيدروجيل. بعد ذلك ، أضف الماء. لكل صلابة ، يكون الحل الأول خاليا من الخرز ، بينما يحتوي الحل الثاني على 03٪ 0.1 ميكروبيدات فلورية.

محليل ديغا الأول والثاني بالتفريغ لمدة 15 دقيقة للتخلص من الأكسجين الذي يمنع البلمرة. بعد ذلك ، أثناء العمل بسرعة ، أضف 0.43٪ TEMED و 0.6٪ من حل APS للمخزون 10 جرام لكل مليلتر إلى الحل الأول. أضف 3.6 ميكرولتر من المحلول إلى وسط كل بئر من الطبق المكون من 24 بئرا.

استخدم على الفور زلات غطاء دائرية مقاس 12 ملم لتغطية الآبار واترك المحلول لمدة 20 دقيقة حتى يتبلمر بالكامل. اضغط برفق على إبرة حقنة على سطح صلب لإنشاء خطاف صغير عند طرفها لتسهيل إزالة زلات الغطاء، ثم استخدم الإبرة لرفع زلات الغطاء. بعد ذلك ، أضف 0.43٪ TEMED و 0.6٪ من محلول APS للمخزون 10 جرام لكل مليلتر إلى الحل الثاني.

ثم ضع 2.4 ميكرولتر من الخليط فوق زلات الغطاء الدائري مقاس 12 ملم. ضع زلات الغطاء الدائري مع قطرة من المحلول الثاني فوق طبقة بولي أكريلاميد الأولى واستخدم ملقطا للضغط برفق لأسفل لضمان صغر سمك الطبقة الثانية. ثم اترك المحلول الثاني يتبلمر لمدة 20 دقيقة.

أضف 500 ميكرولتر من 50 ملليمولار HEPES درجة الحموضة 7.5 إلى كل بئر واستخدم إبرة المحقنة والملقط لإزالة زلات الغطاء الزجاجي. لتعقيم الهلاميات المائية ، ضعها في غطاء مزرعة الأنسجة وعرضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة. الآن ، قم بإعداد خليط من 0.5٪ من الوزن لكل حجم من Sulfo-SANPAH وواحد بالمائة DMSO و 50 مللي مولار HEPES درجة الحموضة 7.5.

أضف 200 ميكرولتر من المحلول إلى السطح العلوي للهلاميات المائية. ثم العمل بسرعة ، قم بتعريضها للأشعة فوق البنفسجية 302 نانومتر لمدة 10 دقائق لتنشيطه. استخدم ملليلترا واحدا من 50 مللي مولار HEPES pH 7.5 لغسل الهلاميات المائية مرتين ، وكرر ذلك إذا لزم الأمر لإزالة أي رابط متقاطع زائد.

قم بتغطية البروتين للهلاميات المائية ب 200 ميكرولتر من 0.25 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجين الأول من ذيل الفئران و 50 ملليمول. احتضن الهلاميات المائية بالكولاجين في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. قبل زرع الخلايا ذات الأهمية على الهلاميات المائية ، أضف ملليلترا واحدا من الوسط وقم بتوازنها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

لزرع الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة البشرية ، بعد زراعة وإعداد تعليق الخلية وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة الوسط من الهلاميات المائية ، ثم أضف ملليلترا واحدا من تعليق الخلية إلى كل بئر. بعد تحضير ثقافة ليلية من L.monocytogenes وفقا لبروتوكول النص ، انقل ملليلترا واحدا من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بتدويره عند 2 ، 000 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. بعد استخدام PBS بدرجة زراعة الأنسجة لغسل الحبيبات مرتين, استخدم ملليلتر واحد من PBS لإعادة تعليق الحبيبات.

قم بإعداد مزيج العدوى عن طريق الجمع بين 10 أو 50 ميكرولتر من المعلق البكتيري مع مليلتر واحد من MCDB 131 كامل الوسط لتعدد العدوى ، أو MOI ، من حوالي 50 بكتيريا لكل خلية مضيفة أو 10 بكتيريا لكل خلية مضيفة. قم بإزالة الوسط من آبار الألواح المكونة من 24 بئرا ، مع الحرص على عدم تعطيل الهلاميات المائية أو الخلايا. استخدم ملليلتر واحد من MCDB 131 كامل الوسط لغسل الخلايا مرة واحدة ، ثم أضف ملليلترا واحدا من البكتيريا إلى كل بئر.

ضع الغطاء على الأطباق ولفه بغلاف طعام من البولي إيثيلين لتجنب التسرب. الطرد المركزي للألواح عند 2 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق لمزامنة الغزو ، ثم احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام MCDB 131 كامل الوسط ، اغسل العينات أربع مرات وأعدها إلى حاضنة زراعة الأنسجة.

بعد 30 دقيقة إضافية ، استبدل الوسيط ب MCDB 131 كامل متوسط مكمل ب 20 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين. لإجراء قياس التدفق الخلوي ، بعد ثماني ساعات من الإصابة ، قم بإزالة الوسط من آبار اللوحة المكونة من 24 بئرا واستخدم زراعة الأنسجة PBS لغسل الآبار مرة واحدة. بعد إزالة PBS ، أضف 200 ميكرولتر من مزيج كولاجيناز التربسين EDTA إلى كل بئر.

ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقائق للسماح بالانفصال الكامل للخلايا. بعد سحب كل بئر برفق ثماني مرات ، أضف 200 ميكرولتر من الوسط الكامل لتحييد التربسين. انقل 400 ميكرولتر من محلول الخلية من كل بئر إلى أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر بغطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر.

تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد زرع خلايا HMEC-1 على الهلاميات المائية Pa ومعالجتها بالجنتاميسين وفقا لبروتوكول النص ، احتضن اللوحة لمدة خمس ساعات للسماح لمروج ActA بتشغيل وتشغيل التعبير عن إطار القراءة المفتوح mTagRFP. بعد أربع ساعات من الإصابة ، امزج ميكرولتر واحد من ملليغرام واحد لكل مليلتر صبغة Hoechst مع مليلتر واحد من L-15 كامل الوسط وأضفه إلى كل بئر لتلطيخ النوى.

بعد احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق ، استبدل الوسط بملليلتر واحد من L-15 كامل متوسط مكمل ب 20 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين. صور مواضع متعددة كل خمس دقائق باستخدام ميزة التركيز التلقائي لمراقبة كيفية انتشار البكتيريا المحورة وراثيا من خلال طبقات أحادية HMEC-1 المصنفة على الهلاميات المائية المتنافسة الصلابة. كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، تم إجراء قياسات AFM لتأكيد الصلابة الدقيقة للهلاميات المائية Pa المعدة باستخدام البروتوكول الموجود في هذا الفيديو.

هنا ، أصيبت خلايا HMEC-1 على درجات الصلابة المختلفة بسلالة LM تعبر عن علامة فلورية بعد الاستيعاب تسمح فقط باكتشاف البكتيريا داخل الخلايا. تم بوابات الخلايا باستخدام مخطط التشتت الأمامي مقابل الجانب واستبعدت خطوة البوابة الثانية الخلايا التي أظهرت التألق الذاتي. كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن عدوى LM كانت أكبر بمقدار الضعف تقريبا على 70 كيلو باسكال مقابل 0.6 كيلو باسكال هيدروجيل.

لاختبار ما إذا كانت زيادة التصاق LMEC-1 ب HMEC-1 زادت من غزو LMEC-1 ، أو كليهما ، كانت مسؤولة عن زيادة القابلية للإصابة بالعدوى بعد فترة وجيزة من الإصابة بالمحور المحور الذي يعبر بشكل أساسي عن GFP ، تم إصلاح خلايا HMEC-1 وتم تلطيخ البكتيريا الملتصقة بالأجسام المضادة. كما هو موضح هنا ، كان هناك عدد أكبر بكثير من البكتيريا الملتصقة ب HMEC-1 عندما تكون الخلايا المضيفة متصلبة مقارنة بالمواد الهلامية اللينة. تمشيا مع بيانات قياس التدفق الخلوي ، هناك عدد أكبر بكثير من البكتيريا التي يتم استيعابها بواسطة HMEC-1 عندما تكون الخلايا المضيفة متصلبة مقارنة بالمواد الهلامية اللينة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذا الاختبار في غضون ثلاثة أيام تقريبا ، حيث توجد خطوات حضانة طويلة مطلوبة بينهما. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون معقما قدر الإمكان للتأكد من أن الهلاميات المائية والخلايا المضيفة خالية من التلوث. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا دمج طرق أخرى مثل الفحص المجهري للقوة الذرية للإجابة على أسئلة مثل كيف تتغير صلابة الخلايا المضيفة عند الإصابة وما إذا كان هذا التأثير يعتمد على صلابة المصفوفة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الميكانيكي لاستكشاف دور التفاعلات الميكانيكية الحيوية لمسببات الأمراض في الخلايا المضيفة باستخدام خلايا مضيفة مختلفة ، مثل الخلايا الظهارية ، ومسببات الأمراض البكتيرية المختلفة ، مثل Rickettsia parkeri. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الهلاميات المائية ذات الصلابة القابلة للضبط على الألواح متعددة الآبار وكيفية إجراء فحص العدوى. لا تنس أن العمل مع البكتيريا المسببة للأمراض يمكن أن يكون خطيرا.

لذلك ، يجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل إدخال الحواجز بين موقع الدخول والممرض ، وكذلك منع توليد الهباء الجوي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.