بسيط Multiwell تصلب الفحص لدراسة الردود خلية تصلب التي تعتمد على أساس بولي أكريلاميد

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في تمكين تحضير هلامات البولي أكريلاميد بشكل سريع وفعال وغير مكلف في تنسيق صفائح متعددة الآبار. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصر محلول السلائف المكون للهلام بين لوح زجاجي مطلي بطبقة كارهة للماء ودعامة بلاستيكية مرنة لاصقة من الأكريلاميد. وتتمثل الخطوة الثانية في تقشير الهلام عن اللوح الزجاجي، حيث يكون قد ارتبط تساهمياً بالدعامة البلاستيكية المرنة عند البلمرة، ثم تركه ليجف.

بعد ذلك، يتم قص الهلام الجاف والدعامة البلاستيكية المرنة الموجودة أسفله إلى الأشكال المطلوبة، وتُلصق بحيث يكون الجانب البلاستيكي مواجهًا لأسفل في قيعان آبار لوحة متعددة الآبار أو أي وعاء آخر لزراعة الخلايا. وتتمثل الخطوة النهائية في تغطية هلامات البولي أكريلاميد المجمعة في اللوحة متعددة الآبار بطبقة لاصقة للخلايا، مثل طبقة أحادية من الكولاجين من النوع الأول. وفي النهاية، يُستخدم المجهر، بالإضافة إلى تقنيات توصيف الخلايا الأخرى، لمراقبة تأثير ركيزة البولي أكريلاميد الأساسية.

وبوجه خاص، تأثير صلابتها على سلوكيات الخلايا. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الحالية في أنها تسمح بالتعامل مع أي درجة صلابة وسُمك للهلامات البوليمرية، بالإضافة إلى تجميعها في تنسيق أطباق متعددة الآبار، بطريقة منخفضة التكلفة وفعالة زمنياً، وهو ما لا توفره الطرق الأخرى. وسيتم استعراض الإجراء من قبل طالب في مختبري.

أولاً، قم بتحضير المحلول السلائف لهلام البولي أكريلاميد عن طريق خلط الأكريلاميد والمادة الرابطة متصالبة البس-أكريلاميد والماء منزوع الأيونات. قم بإذابة Sul OPA في ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 50 mg/mL. قم بتقسيم 20 µL من المحلول المخزون في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة. بعد ذلك، قم بالتجميد السريع للمحاليل في نيتروجين سائل واحفظها في درجة حرارة -80 °C.

بعد ذلك، قم بإذابة كبريتات الأمونيوم بيرسلفات في ماء منزوع الأيونات للوصول إلى تركيز نهائي من كبريتات الأمونيوم بيرسلفات يبلغ 10% وزناً/حجماً. وزع 25 µL من محلول كبريتات الأمونيوم بيرسلفات في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة، واحفظها في درجة حرارة -20 °C. قم بتحضير محلول كولاجين بتركيز 0.2 mg/mL عن طريق تخفيف المحلول المخزون من كولاجين النوع الأول في 1XPBS عند pH 7.4.

تُحفظ جميع المحاليل على الثلج حتى وقت الاستخدام. في هذه المرحلة، ضع بضع قطرات من محلول كاره للماء على شريحة زجاجية واستخدم ورق المناديل لتوزيعه على السطح. بعد ترك الشريحة لتجف في الهواء، امسحها بورق المناديل مرة أخرى لضمان استواء الطبقة الكارهة للماء.

قص دعامة بلاستيكية مرنة لتناسب حجم الشريحة الزجاجية المطلية بطبقة كارهة للماء. ثم حدد الجانب الكاره للماء من الدعامة البلاستيكية المرنة عن طريق خدش السطح بخفة باستخدام أداة حادة مثل المشرط. ولتحضير الهلام، أضف 4972.5 µL من محلول سلائف البولي أكريلاميد بالتركيز النهائي المطلوب في أنبوب مخروطي سعة 50 mL.

ضع الأنبوب في غرفة إزالة الغازات لمدة 30 دقيقة مع ترك الغطاء مفتوحاً. بعد ذلك، أضف 25 µL من محلول كبريتات الأمونيوم المُحضر مسبقاً إلى محلول هلام DGAs للوصول إلى تركيز نهائي من كبريتات الأمونيوم يبلغ 0.05%. ثم أضف 2.5 µL من TM me للوصول إلى تركيز نهائي من TM ME يبلغ 0.5%. اخلط المحلول برفق عن طريق السحب والضخ بالماصة من ثلاث إلى خمس مرات. بعد ذلك، ضع فواصل سيليكونية بالسُمك المطلوب على الجانب المحب للماء للدعامة البلاستيكية المرنة.

ثم يتم نقل محلول الهلام باستخدام الماصة إلى الدعامة البلاستيكية المرنة بين الفواصل، وتُغطى بشرائح زجاجية مطلية بمادة كارهة للماء بشكل خفيف. بعد ترك الهلام ليبلمر لمدة 45 دقيقة، يتم نزع الدعامة البلاستيكية المرنة مع هلام البولي أكريلاميد المرتبط تساهمياً في الأعلى، وتوضع بحيث يكون جانب الهلام للأعلى ليجف في الهواء. وبمجرد جفافه، يُقطع هلام البولي أكريلاميد إلى الأشكال المطلوبة.

قم بتحضير ما يقرب من 500 µL من polymethyl soane لكل لوح ذو 96 بئراً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة للصق الهلامات بقاع اللوح متعدد الآبار. ضع قطرة صغيرة من Polymethyl soane في مركز كل بئر باستخدام ملقط. ضع هلام poly acrylamide واحداً في كل بئر بحيث يكون جانب الدعم البلاستيكي المرن لأسفل.

بعد معالجة بولي ثنائي ميثيل السيلوكسان، ضع كمية صغيرة من عينة السليلوز المُحضرة مسبقاً في كل بئر باستخدام ماصة نقل، ثم حركها من جانب إلى آخر لتغطية سطح الهلام بشكل متساوٍ. ضع لوحة الآبار تحت مصباح UV عالي الكثافة لمدة خمس دقائق. وعند الانتهاء، اشطف الهلامات باستخدام PBS لإزالة السليلوز الزائد.

باستخدام هذه الماصة، يتم وضع 50 µL تقريبًا من محلول الكولاجين النوع الأول (collagen Type one) الذي تم تحضيره مسبقًا في كل بئر. تُترك اللوحة مغطاة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل، ثم تُشطف باستخدام PBS لإزالة محلول الكولاجين الزائد. يتم تعقيم الهلامات (gels) تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) في غطاء زراعة الأنسجة لمدة ساعتين.

أخيرًا، انقع الهلامات في وسط مغذٍ كامل طوال الليل للترطيب والموازنة. استخدم الهلامات لزراعة الخلايا فوراً أو احفظها في الثلاجة لمدة تصل إلى يومين. يظهر هنا معامل يونج كدالة لعدة تركيزات من الأكريلاميد والبيس-أكريلاميد، والمشار إليهما بالرمزين A و B على التوالي، كما هو متوقع.

يكون كل من معامل التخزين G' ومعامل الفقد G'' مستقلين عن التردد. كما تم التأكد من أن تجفيف الهلامات ثم إعادة ترطيبها لم يؤثر على معامل يونغ الخاص بها. وباستخدام الرابط التشابكي Sulo sampa، يمكن تحقيق طلاء كولاجين متجانس على الهيدروجيلات بغض النظر عن درجة صلابتها.

لوحظ أنه عند استزراع خلايا سرطان الثدي M-D-A-M-B 2 31 على هلامات البولي أكريلاميد لمدة 24 ساعة، ظلت الخلايا مستديرة على الهلامات الرخوة بصلابة 0.5 و1 كيلو باسكال، ولكنها تمكنت من الانتشار والاستطالة على الهلام الصلب بصلابة 100 كيلو باسكال. بالإضافة إلى ذلك، فإن الهلامات المائية المصنعة فوق الدعامة البلاستيكية المرنة تكون شفافة وتسمح بالتصور والتحليل المجهري السهل. علاوة على ذلك، لا تُظهر الدعامة البلاستيكية المرنة تألقاً ذاتياً، وبالتالي لا تتداخل مع تصوير الخلايا الموسومة فلورياً.

تم قياس مورفولوجيا الخلايا بشكل كمي إضافي من حيث مساحة انتشار الخلايا الإجمالية وتدوير الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع هلامات البولي أميد في تنسيق لوحة متعددة الآبار بكفاءة وبتكلفة منخفضة، وذلك لدراسة بيولوجيا الخلايا المعتمدة على الصلابة.