دراسة آثار تصلب مصفوفة على وظيفة الخلوية باستخدام الأكريلاميد المستندة الهلاميات المائية

لنمذجة امتثال الأنسجة في الجسم الحي باستخدام هيدروجيل الأكريلاميد. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء زلات الغطاء السفلي التفاعلية أولا وزلقات الغطاء العلوي المصنوعة من السيليكون. الخطوة الثانية من الإجراء هي صب وإنشاء هيدروجيل الأكريلاميد.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي ربط بروتين المصفوفة خارج الخلية المفضل بالهيدروجيل. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي حضانة الخلايا وتحليلها. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح كيف ينظم امتثال المصفوفة خارج الخلية المتغير في المختبر سلوك الخلية من خلال التحليل باستخدام الفحص المجهري المناعي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي والنشاف الغربي.

سنعرض لك اليوم إجراء توليد واستخدام الهلاميات المائية الأكريلاميد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة صلابة المصفوفة خارج الخلية التي تنظم مورفولوجيا الخلية وإشارات الخلية والانتشار. لذلك دعونا نبدأ.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق إنشاء زلات غطاء تفاعلية. ضع أولا طبقة من الطفيلي في النصف السفلي من طبق بتري مقاس 150 ملم. ثم انقل ما يصل إلى تسعة غطاء أوتوكلاف 25 ملم على الفيلم وقم بتغطيتها بمليلتر واحد من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار.

احتضان زلات الغطاء لمدة ثلاث دقائق بعد الحضانة ، قم بشفط هيدروكسيد الصوديوم بخط تفريغ يعمل في ماصة غطاء كيماوية 0.5 مل من ثلاثة ثلاثي ميثيل أمينو أو ثلاثة A-P-T-M-S على كل زلة غطاء. احتضان زلات الغطاء لمدة ثلاث دقائق ثم استنشق الثلاثة A-P-T-M-S. توخي الحذر من عدم التحضين لفترة طويلة لتجنب تكوين الرغوة على الغطاء.

الانزلاق بعد العلاج. شطف زلات الغطاء مرة واحدة مع 20 مل من الماء منزوع الأيونات في نفس الطبق. قم بإزالة زلات الغطاء من الطبق باستخدام ملقط منحني وانقلها إلى الجانب المعالج بحيث يكون متجها إلى طبق جديد بحجم 150 ملم.

ثم اغسل زلات الغطاء بالماء منزوع الأيونات مرة أخرى وضعها على الروك لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بإزالة الماء واغسله مرتين إضافيتين. من المهم جدا إزالة جميع أنواع A-P-T-M-S الثلاثة حتى لا تتفاعل مع الجلوتارالديهايد وتترك راسب أبيض غائما قبل 10 دقائق من استخدامه للجلوتارالديهايد.

باستخدام ملقط منحني ، انقل زلات الغطاء إلى طبق نظيف مع طبقات من البارام وشفط أي سائل متبقي باستخدام خط مفرغ ، ثم قم بتغطية كل زلة غطاء بالكامل ب 0.5 مل من 0.5٪ جلوتارالديهايد في ماء معقم منزوع الأيونات لربط الثلاثة A-P-T-M-S وهلام بولي أكريلاميد. احتضان زلات الغطاء لمدة 30 دقيقة في غطاء كيميائي. ثم قم بشفط الجلوتارالديهايد واشطفه واغسل زلات الغطاء مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات.

ثم جفف الغطاء ينزلق تماما. أضف زلات غطاء جديدة إلى أنبوب فالكون سعة 50 مليلتر يحتوي على محلول مانع للتسرب السطحي بنسبة 10٪ في الكلوروفورم والصخور لمدة 10 دقائق على الأقل. صب محلول ختم السطح وجففه في الهواء.

ينزلق الغطاء على مناديل كيم المبللة في خزانة السلامة البيولوجية حيث سيتم تحضير الهلاميات المائية لبدء تحضير الهيدروجيل. استخدم ملقطا منحنيا لنقل الجانب التفاعلي لزلات الغطاء إلى ورقة من الطفيلي التي تم لصقها على سطح خزانة السلامة البيولوجية. تأكد من أن زلات الغطاء مسطحة على سطح الطفيل.

ثم قم بإعداد مساعد CIN مشبع وهيدروكسي أو محلول NHS في التولوين عن طريق إذابة كمية صغيرة من NHS في ما يكفي من التولوين. بالنسبة للتجارب المحددة ، أضف كميات صغيرة من NHS حتى لا تذوب NHS. عادة ما يكون المحلول المشبع غائما وورديا.

بعد ذلك ، قم بإعداد ماء أكريلاميد أكريلاميد BIS و PS للوصول إلى نسبة الأكريلاميد المطلوبة. أضف الكواشف إلى أنابيب الاستخدام الجزئي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ثم حصة واحدة في كل مرة.

أضف NHS و TM لي. دوامة الأنبوب لفترة وجيزة وعلى الفور صب ما بين ثلاثة إلى خمسة مواد هلامية باستخدام 140 ميكرولتر لكل زلة غطاء في خزانات السلامة البيولوجية. ضع بسرعة زلة غطاء السيليكون مقاس 25 ملم فوق كل هلام قبل أن تبدأ في البلمرة.

ستسمح إضافة زلة الغطاء العلوي للأكريلاميد بتغطية زلة الغطاء السفلي بالكامل. احتضن هذه الشطيرة في درجة حرارة الغرفة حتى يتبلمر مادة الأكريلاميد لتحديد وقت حدوث البلمرة. افحص محلول الأكريلاميد المتبقي في أنبوب الطرد المركزي الصغير.

ستستغرق البلمرة بضع دقائق للمواد الهلامية الصلبة وأطول قليلا للهلاميات الرائضة. بمجرد حدوث البلمرة ، التقط الساندويتش بعناية مرتديا قفازات معقمة. ثم انزلق من زلة الغطاء العلوي حتى يتدلى من الجل المبلمر.

ثم نقب الغطاء. انزلق من الجل ، وتخلص من زلة الغطاء العلوي. ضع كل زلة غطاء جل سفلية تسمى الهيدروجيل فيما بعد في صفيحة من ستة آبار.

بعد ذلك ، أضف ملليلترين من محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS لكل بئر من ستة آبار. ثم اغسل الهلاميات المائية باستخدام PBS واحتضانها على الروك لمدة خمس دقائق. كرر هذا الغسيل مرتين.

لبدء التجربة ، قم بتغطية كل هيدروجيل بملليلترين من محلول الفيبرونيكتين أو بروتين مصفوفة خارج الخلية آخر. احتضان البروتين على الهيدروجيل طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح له بالارتباط تساهميا بالهيدروجيل بعد الحضانة طوال الليل ، واستنشق محلول ECM. ثم قم بمنع NHS غير التفاعلي بملليغرام واحد لكل مليلتر من ألبومين مصل الأبقار المنشط الخالي من الأحماض الدهنية في وسائط خالية من المصل واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، اغسل الهلاميات المائية مرة واحدة باستخدام PBS المعقم. بعد ذلك ، قم بوضع الخلايا في الوسط المزروع المناسب الذي يحتوي على مصل الأبقار الجنينية. على الهيدروجيل هنا.

استخدام الخلايا الليفية الجنينية للفأر. حدد عدد الخلايا التي سيتم زرعها على الهيدروجيل بناء على درجة انتشار الخلايا والتقاء المطلوب للتجريب. تقريبا 10 إلى الخلايا الخمس اللازمة للطخة غربية وتحليل PCR الكمي.

ثم احتضان الخلايا في ظل الظروف المناسبة لنوع الخلية المحدد. بعد فترة الحضانة. استخرج بروتين الخلية أو mRNA حسب الحاجة.

توضع الماصة سعة 100 ميكرولتر قطرات من المخزن المؤقت للتحلل على ورقة من الطفيلي على مقعد المختبر ، تاركة ما يقرب من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات بين كل قطرة. بعد ذلك ، قم بإزالة كل هيدروجيل بعناية عن طريق رفع زلة الغطاء السفلي من البئر. باستخدام ملقط منحني ووضع جانب الخلية لأسفل فوق القطرات.

احتضان الخلايا مع المخزن المؤقت للتحلل لمدة دقيقة واحدة بالضبط. أخيرا ، قم بإزالة زلات الغطاء وانقل عازلة التحلل إلى أنبوب طرد مركزي صغير. بدلا من ذلك ، عند استخراج الحمض النووي الريبي ، انقل كل هيدروجيل إلى صفيحة جديدة من ستة آبار وأضف ملليلترا واحدا من التريازول لكل بئر.

احتضن المواد الهلامية لمدة ثلاث دقائق بعد الحضانة. قم بإزالة محلول التريازول للتخزين في أنبوب طرد مركزي صغير. يعد الغسيل الشامل لزلات الغطاء بعد إضافة A-P-T-M-S خطوة مهمة في إنتاج زلات الغطاء التفاعلية.

زلات الغطاء المغسولة والجافة بشكل صحيح خالية من أي بقايا من الرواسب. سوف يتفاعل A-P-T-M-S مع الجلوتارالديهايد وينتج راسب أبيض غائما. إذا كان الراسب ، فيجب تكرار الإجراء بأكمله لأن قسيمة الغطاء لم تعد قابلة للاستخدام.

بعد تكوين الهيدروجيل والطلاء ببروتينات ECM ، يتم زرع الخلايا بين عشية وضحاها. هناك فرق واضح بين الخلايا التي تنتشر على الهلاميات المائية الصلبة مقابل الهلامية اللينة كما يمكن رؤيته من خلال الخلايا الليفية الجنينية في تلطيخ الخلايا الليفية الجنينية التي تنتشر إلى حد كبير على الصلابة مقارنة بالهيدروجيليات اللينة. في الواقع ، ستظل معظم الخلايا المرتبطة بهيدروجيل ناعم مضغوطة وتتعلق بشكل أقل كفاءة.

تظهر نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية التمثيلية لركوب الدراجات D واحد مستويات mRNA في الخلايا الليفية الجنينية للفأر أن ركوب الدراجات D واحد يتم تنظيمه بشكل كبير على مصفوفة صلبة ، ولكن ليس على مصفوفة ناعمة. يشير هذا إلى أن صلابة المصفوفة تنظم تقدم دورة الخلية في المختبر. لقد أوضحنا لك للتو كيفية توليد صلابة قطع الهيدروجيل ، والنمذجة في الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إجراء زلات غطاء تفاعلية إضافية حيث سيحدث حادث وخطأ.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.