اختبار دور البلازميدات Multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية

الهدف العام لهذه الطريقة التجريبية هو اختبار دور البلازميدات متعددة النسخ في تطور مقاومة المضادات الحيوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة مثل دور البلازميدات متعددة النسخ في تطور الابتكارات البكتيرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب سوى طرق البيولوجيا الجزيئية الأساسية والتصميم التجريبي البسيط.

إنه رائع حقا. أولا ، قم ببناء سلالة e coli MG1655 التي ستحمل جين مقاومة الأجسام المضادة في الكروموسوم في عاثية لامدا في جانب المعادلة ATTB. للقيام بذلك ، يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم 500 منطقة بارالونج الأساسية على جانبي موقع ATTB.

ثم يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم جين مقاومة المضادات الحيوية. ثم استخدم التجميع متساوي الحرارة عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لدمج مناطق التماثل مع منتج PCR. بعد التجميع متساوي الحرارة ، انقل ميكرولتر واحد من المنتج إلى 40 ميكرولترا من خلايا MG1655 ذات الكفاءة الكهربائية إلى كوفيت بحجم ملليمترين.

ثم قم بالكهرباء للخلايا عند 4 درجات مئوية و 2.5 كيلو فولت. بعد التثقيب الكهربائي ، انقل الخلايا في مليلتر واحد من مرق LB مع 0.2٪ أرابينوز. ثم ماصة مرق LB المحتوي على خلايا في أنبوب ميكروفوج.

رج الأنبوب بشكل مكثف لمدة ساعتين عند 30 درجة مئوية. بعد ساعتين ، لوحة 100 ميكرولتر من الثقافة على لوحة أجار LB ، مكملة بالمضادات الحيوية. ثم قم بتدوير الخلايا المتبقية.

وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من مرق LB الطازج. أعد وضع هذه الخلايا على لوحة أجار LB أخرى. ثم احتضان الصفائح عند 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم المستنسخة للتحقق من البناء باستخدام البادئات الخارجية ybhC الخارجية و ybhB الخارجية. ثم قم بتأكيد حجم الأمبليكون من خلال الرحلان الكهربائي لقشرة الاغاروز. بالتوازي مع ذلك ، قم بإجراء تسلسل الحمض النووي للتحقق من تسلسل الجين المدخل.

لبناء السلالة لحمل جين مقاومة الأجسام المضادة في البلازميد متعدد النسخ ، يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل أولا بتضخيم جين مقاومة المضادات الحيوية blaTEM-1. بعد اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بفسفرة المنتج المضخم باستخدام T4 بولي نوكليوتيد كيناز. بعد ذلك ، استخدم البوليميراز عالي الدقة وقليل النوكليوتيدات PBAD FINV و PBAD RINV ، لتضخيم PCR العمود الفقري للبلازميد PBAD.

ثم قم بربط جزأين من PCR باستخدام T4 ligase. بعد ذلك ، قم بتكليف 40 ميكرولتر DH5 خلايا ألفا مع 1 ميكرولتر من منتج الربط. ثم حدد المضاد الحيوي المناسب لجين مقاومة المضادات الحيوية والعمود الفقري البلازميد على ألواح الأجار.

ثم قم بإجراء استخراج البلازميد باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. ثم قم بإجراء تسلسل سانجر لجين المقاومة محل الاهتمام لتأكيد عدم وجود أي طفرات محتملة قبل تجارب التطور. بعد التحقق من التسلسل ، قم بالكهرباء البلازميد في سلالة الإشريكية القولونية MG1655 للحصول أخيرا على البلازميد الذي يحمل سلالة MG1655.

تتمثل الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول في بناء سلالات الأنظمة النموذجية وإعادة بناء الطفرات التي لوحظت أثناء التطور التجريبي. أولا ، قم بربط سلالات MG1655 ذات الأهمية على ألواح أجار LB. ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط LB في كل بئر من لوحة 96 بئر.

بعد ذلك ، قم بتلقيح 48 مستعمرة معزولة من كل سلالة في آبار فردية من اللوحة. بعد التلقيح ، احتضن الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية على شاكر بسرعة 200 دورة في الدقيقة. مرة أخرى ، قم بتلقيح ميكرولترين من الثقافة من كل بئر مع السكان المؤسسين إلى صفيحة بئر جديدة 96 مع 198 ميكرولتر من وسط LB في الآبار الفردية.

سيبدأ هذا تجربة الإنقاذ التطورية. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية على شاكر بمعدل 200 دورة في الدقيقة لمدة 20 ساعة. كل يوم ، ضاعف تركيز المضاد الحيوي عن تركيز اليوم السابق.

في اليوم التالي ، انقل 2 ميكرولتر من الثقافة المعنية إلى طبق 96 بئر طازج واستمر في ذلك كل يوم. سجل قراءة الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر من الآبار الفردية على قارئ الألواح. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في التطور التجريبي وتركيزاتها المتزايدة من المضادات الحيوية.

معدل تغير تركيزات المضادات الحيوية أحد المعلمات التي يمكن تعديلها لتعزيز تطور مقاومة المضادات الحيوية. مرة أخرى ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية على شاكر بمعدل 200 دورة في الدقيقة لمدة 20 ساعة. ثم قم بقياس قراءة الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر لكل مجموعة سكانية على قيد الحياة يوميا على قارئ اللوحة.

قم بتجميد السكان بشكل دوري ، كل ثلاثة إلى خمسة أيام. استخرج الحمض النووي الكلي من المجموعات السكانية المتطورة والنسخ من سلالات وعلاجات مختلفة. بعد ذلك ، قم بقياس نسب الامتصاص عند 260:280 و 260:230 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي لتحديد جودة الحمض النووي.

ثم استخدم صبغة ربط الحمض النووي الفلورية وتأكد من تركيز الحمض النووي عن طريق قياس التألق على قارئ اللوحة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإخضاع الحمض النووي للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للتأكد من عدم وجود تدهور للحمض النووي أو تلوث الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، قم بإجراء تسلسل عميق للحمض النووي مع العينات التي تم الحصول عليها من مجموعات سكانية بأكملها المستنسخة الفردية لدراسة الأساس الجيني لمقاومة المضادات الحيوية.

هذه الدراسة هي مثال على النتائج المحتملة للنظام التجريبي باستخدام ثلاث سلالات من الإشريكية القولونية. هذه السلالات هي e coli MG1655 و MG1655 التي تحمل جين المقاومة في الكروموسوم MG1655 resA و MG1655 التي تحمل جين المقاومة في البلازميد متعدد النسخ ، MG1655 pRESA. المضادات الحيوية المستخدمة هي سيفتازيديم وميروبينيم.

تظهر هذه اللوحة اليسرى منحنيات البقاء على قيد الحياة تحت تركيزات متزايدة من سيفتازيديم. من المؤامرة ، من الواضح أن المجموعة الفرعية من سلالة MG1655 pRESA قادرة على النمو لأكثر من 14 يوما حتى بعد مضاعفة تركيز السيفتازيديم كل يوم. على العكس من ذلك ، فإن السلالات الأخرى لا تعيش أكثر من 8 أيام عند تعرضها لتركيزات مماثلة من سيفتازيديم.

ومع ذلك ، لا تظهر السلالات نفسها اختلافات كبيرة في فترة البقاء على قيد الحياة عند تعرضها لتركيز مماثل لمضاد حيوي آخر ، ميروبينيم. تعيش جميع السلالات الثلاث فقط ما بين 6 إلى 8 أيام عند تعرضها للميروبينيم. يشير هذا إلى أن وجود الجين resA في البلازميد متعدد النسخ يحفز تطور المقاومة ضد سيفتازيديم ولكن ليس ميروبينيم.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ البروتوكول التجريبي الكامل في غضون أسابيع قليلة إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقيق في دور البلازميدات متعددة النسخ في تطور الابتكارات في البكتيريا.