المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

يوفر هذا البروتوكول الباحثين مع أداة جديدة لرصد الإخلاص للنسخ في الكائنات نموذج متعددة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطفرات النسخية مثل الوحدات الفرعية لبوليميراز الحمض النووي الريبي أو العمليات البيولوجية التي تتحكم في دقة النسخ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس أخطاء النسخ الذاتية في نسخ الكائنات حقيقية النواة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذا البروتوكول بسبب طول وتعقيد الفحص والحاجة إلى المعلوماتية الحيوية المتقدمة من أجل تفسير البيانات.

لبدء البروتوكول ، قم بتعميم شظايا الحمض النووي الريبي عن طريق تغيير طبيعة 20 ميكرولترا من العينة المعدة مسبقا عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد دقيقة واحدة ، ضع العينة على الفور على الجليد لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، أضف أربعة ميكرولترات من 10x T4 RNA ligase buffer ، وأربعة ميكرولترات من 10 مللي Molar ATP ، وميكرولتر واحد من مثبط RNase ، وميكرولتر واحد من الماء الخالي من النوكلياز ، وثمانية ميكرولترات من 50٪ بولي إيثيلين جلايكول ، أو PEG.

ثم امزج العينة جيدا عن طريق الدوامة. ثم أضف ميكرولترين من 10 وحدات لكل ميكرولتر من T4 RNA ligase واحد. امزج العينة مرة أخرى عن طريق سحب العينة واحتضانها عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين في جهاز تدوير حراري مع ضبط درجة حرارة الغطاء على 30 درجة مئوية.

بعد الحضانة لمدة ساعتين ، أضف 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى العينة ونظف العينة باستخدام مجموعة أدوات تنظيف وتركيز oligo. قم بمسح العينة في 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. لعكس نسخ جزيئات الحمض النووي الريبي الدائري ، أضف أربعة ميكرولترات من 10 ملليمولار dNTPs ، وأربعة ميكرولترات من 50 نانوغرام لكل ميكرولتر من السداسيات العشوائية ، وتسعة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكلياز إلى تسعة ميكرولتر من الحمض النووي الريبي.

تخلط جيدا عن طريق سحب العينة وتشويهها عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد تغيير طبيعة العينة ، ضعها على الجليد لمدة دقيقتين. أضف ثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت لتخليق الخيط الأول 5x ، وميكرولترين من 0.1 مللي مولار DTT ، وأربعة ميكرولترات من 200 وحدة لكل ميكرولتر من النسخ العكسي إلى العينة واخلطها عن طريق سحب العينات.

احتضان العينة عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع ضبط الغطاء بخمس درجات مئوية أعلى من درجة حرارة الحضانة. ثم احتضان العينة لمدة 20 دقيقة عند 42 درجة مئوية مع ضبط الغطاء على 47 درجة مئوية. قم بإزالة العينة في 42 ميكرولتر من محلول الشطف بعد التنظيف باستخدام مجموعة التنظيف والمكثف.

استخدم مجموعة توليف الخيوط الثانية لإنشاء مكتبة (كدنا) مزدوجة الشريطة. ضع العينات على الثلج وأضف 30 ميكرولترا من ماء NF إلى 38 ميكرولترا من العينة. بعد ذلك ، أضف ثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت للحبلا 10x ثانية وأربعة ميكرولترات من إنزيم الخيط الثاني واخلط العينة عن طريق سحب العينة بلطف قبل الحضانة عند 16 درجة مئوية لمدة ساعتين ونصف.

قم بتنظيف العينات باستخدام مجموعة أدوات التنظيف والتركيز oligo لتفاعلات 100 ميكرولتر وقم بمسح العينات في 38 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. امزج تفاعل الإصلاح النهائي عن طريق سحب العينة واحتضانه عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اتبع الحضانة 20 درجة مئوية مع حضانة لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية.

أولا ، قم بتخفيف المحولات لتسلسل الجيل التالي عشرة أضعاف في 10 مللي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك إلى تركيز نهائي يبلغ 1.5 ميكرومولار. ثم أضف 2.5 ميكرولتر من المحول المخفف وميكرولتر واحد من محسن الربط لكل عينة واخلطها عن طريق الدوامة. بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من مزيج TA ligase الرئيسي الحاد.

قم بضرب العينة لأعلى ولأسفل لخلطها واحتضانها على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولترات من إنزيم كاشف الاستئصال الخاص باليوراسيل واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد اكتمال الربط ، أضف 13.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى العينة لحجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر وانتقل إلى اختيار الحجم.

تأقلم الخرز المغناطيسي مع درجة حرارة الغرفة. أضف 30 ميكرولترا من الخرزات المغناطيسية المتأقلمة والمعلقة إلى كل عينة واخلطها عن طريق سحب العينات. انقل العينة إلى أنبوب سعة 1.5 مل واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ضع العينة على حامل مغناطيسي لمدة خمس دقائق لفصل الخرزات عن المادة الطافية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وتخلص من الخرز المغناطيسي. أضف كمية جديدة من 15 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي إلى كل عينة.

تخلط جيدا عن طريق سحب العينة وتحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع العينات على رف مغناطيسي واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة المواد الطافية والتخلص منها بعناية ، مع التأكد من عدم إزعاج الخرز.

أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول المحضر حديثا بنسبة 80٪ إلى كل عينة دون إزعاج الخرزات المغناطيسية المحببة واحتضانها لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بإزالة أي أثر للإيثانول بالكامل من العينات وجفف الخرزات بالهواء لمدة خمس دقائق ، ولكن احرص على عدم الإفراط في تجفيف الخرز. لإزالة العينات من الخرز ، قم بإزالة الأنابيب من الحامل المغناطيسي.

أضف 19 ميكرولترا من 10 ملمولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، قم بإخراج المزيج لأعلى ولأسفل عدة مرات لإعادة تعليق الخرزات واحتضان العينات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع العينات مرة أخرى على الحامل المغناطيسي واحتضانها لمدة خمس دقائق لفصل الخرزات عن المادة الطافية.

قم بإزالة 15 ميكرولترا من المادة الطافية التي تحتوي على مكتبات (كدنا) المنقاة والمختارة حسب الحجم من الأنابيب وقم بنقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف خمسة ميكرولترات من البرايمر العالمي وخمسة ميكرولترات من برايمر فهرس فريد إلى كل مكتبة (كدنا) منقاة واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات. تحقق بعناية من مزيج البوليميراز الرئيسي بحثا عن البلورات والرواسب الأخرى وقم بتسخين المزيج الرئيسي يدويا حتى تذوب الرواسب.

أضف 25 ميكرولترا من مزيج البوليميراز الرئيسي إلى العينة. امزج العينة عن طريق سحب العينة واتبع شروط التدوير المدرجة في بروتوكول النص المصاحب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتنظيف المكتبات النهائية عن طريق إضافة 45 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المعلق مباشرة إلى تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

امزجها عن طريق سحب العينات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. انقل العينة إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر وضعها في حامل مغناطيسي لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، تخلص من المادة الطافية واغسلها مرتين بالإيثانول الطازج بنسبة 80٪ لمدة 30 ثانية.

بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة الإيثانول بالكامل من العينة وجفف حبيبات الخرزة بالهواء لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالته في 35 ميكرولتر من 0.1x TE. أعد تعليق الخرزات عن طريق ماصتها واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد أن يكون الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة خمس دقائق ، انقل 30 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتخزين المكتبات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد عزل الحمض النووي الريبي ، تظهر قمتان متميزتان من الرنا الريبي المرسال على مخطط كهربية الفريستورام. سيؤدي تجزئة الحمض النووي الريبي إلى 50 إلى 70 جزءا من الحمض النووي الريبي الزوج الأساسي.

تم استخدام النسخ العكسي للدائرة المتدحرجة لتوليد جزيئات (كدنا) التي تتكون من ثلاثة تكرارات ترادفية على الأقل لقوالب الحمض النووي الريبي الدائرية. يسمح اختيار الحجم بالخرز المغناطيسي بتنقية المكتبات ذات الحجم المناسب. تظهر معلومات التسلسل لمكتبة C-seq واحدة أن معظم التكرارات تميل إلى أن يتراوح طولها من 45 إلى 80 قاعدة.

ما يقرب من 50٪ من القواعد التي تم تسلسلها هي جزء من هذه التكرارات. نظرا لأن معظم هذه القواعد موجودة في معدلات تحتوي على ثلاثة تكرارات أو أكثر ، فإن عدد القواعد الفريدة التي يتم تسلسلها يبلغ حوالي ثلث العدد الإجمالي للقواعد المتسلسلة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إلى ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم دائما الحفاظ على بيئة عمل معقمة ، خالية من الحمض النووي الريبي الذي يمكن أن يتداخل مع عملك. من المهم أيضا اتباع كل خطوة بعناية لضمان عدم ارتكاب أي أخطاء أثناء العملية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس أخطاء النسخ في حقيقيات النوى باستخدام مقايسة C-seq.