"حدد أمداً" الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات"

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تصور الإجراءات التدريجية المتضمنة في اختبار طفرة Lambda Select cII في الخلايا المستنبتة من القوارض المعدلة وراثيا أو المقابلة المعالجة بعوامل كيميائية وفيزيائية ذات أهمية. يمكن أن تساعد طريقة الاختبار هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الطفرات مثل ، هل مركب الاختبار مطفر؟ وإذا كان الأمر كذلك ، فما مدى قوة المطفرة؟

هل يحفز طفرات خاصة بالتسلسل؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ضئيلة لأي مركب اختبار تقريبا. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار الطفرات في خلايا الثدييات باستخدام جين مراسل متكامل كروموسوما.

لتكوين تفاعل تغليف واحد ، أضف خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي الجيني في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على مزيج التفاعل الأول. ثم احتضان الأنبوب عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف 12 لترا صغيرا من مزيج التفاعل الثاني إلى الأنبوب واتركه لمدة 90 دقيقة أخرى عند 30 درجة مئوية.

بعد 90 دقيقة ، أضف 1.1 مل من المخزن المؤقت SM إلى الأنبوب. ثم قم بدوامة الأنبوب بقوة مع الحمض النووي المعبأ في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثوان تقريبا. أعط بسرعة نبضة تدور في جهاز الطرد المركزي الصغير.

ثم اترك الأنبوب على الثلج حتى الاستخدام. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من الكلوروفورم لكل مليلتر من الحمض النووي المعبأ. إذا لم تتم معالجة العينة في نفس اليوم ، فقم بتدوير العينة برفق وتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

قم بإعداد 16 أنبوبا دائريا معقما و 16 لوحة أجار TB1 لعينة واحدة من الحمض النووي المعبأة. استخدم عشرة أنابيب للفحص وستة للمعايرة. ثم قم بنقل 300 ميكرولتر من ثقافة الطلاء G1250 في كل أنبوب دائري القاع.

بعد ذلك ، إلى العيار ، أضف 10 ميكرولترات من الحمض النووي المعبأ إلى 990 ميكرولتر من المخزن المؤقت SM و 1: 100 تخفيف. ثم دوامة العينة. أضف 20 أو 100 ميكرولتر من محلول الحمض النووي 1: 100 إلى كل من أنابيب العيار الثلاثة 20 أو 100 على التوالي.

لغرض الفحص ، أضف 100 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المعبأة غير المخففة إلى كل من أنابيب الفحص ال 10. قم بمعالجة جميع أنابيب المعايرة والغربلة البالغ عددها 16. دوامة الأنابيب لمدة 10 ثوان لخلط المكونات.

ثم احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى يمتص المضيف بكتريا قولونية العاثيات. بعد ذلك ، أضف 2.5 مل من أجار TB1 العلوي المنصهر. حافظ على درجة حرارة 55 درجة مئوية إلى أنابيب المعايرة والغربلة المناسبة.

بعد الإضافة ، قم بدوامة الأنابيب على الفور برفق. الآن ، اسكب أجار TB1 على العيار المناسب أو صفيحة أجار TB1. اترك الأطباق تقف لمدة 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد أن يصلب الأجار ، اقلب واترك جميع لوحات الغربلة ال 10 في الحاضنة الثابتة عند 24 درجة مئوية لمدة 46 إلى 48 ساعة. اترك ألواح العيار الستة المتبقية في حاضنة ثابتة عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو ليوم واحد. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية ، احسب عدد اللويحات المتكونة في جميع الألواح 3 عيار 20 و 100 صفائح.

بعد الحضانة عند 24 درجة مئوية ، احسب عدد اللويحات المتكونة في 10 لوحات غربلة. للتحقق من اللويحات الطافرة المعلنة ، قم بقلب اللوحة بطرف ماصة معقمة عريضة التجويف. ثم انقل اللوحة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم مملوء ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت SM المعقم.

ثم احتضان أنبوب الطرد المركزي الدقيق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، امزج ميكرولتر واحد من محلول العاثية المحفور مع 200 ميكرولتر من ثقافة الطلاء G1250 في أنبوب سفلي دائري معقم. ثم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، ضع محلول العاثية المحفور في 2.5 مل من أجار TB1 العلوي المنصهر واحتضانه عند 24 درجة مئوية لمدة 46 إلى 48 ساعة. بمجرد أن تصبح اللويحات الثانوية مرئية ، استخدم طرف ماصة لاختيار لوحة Lambda cII متحولة معزولة جيدا. انقل اللوحة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مملوء ب 25 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج في الماصة عدة مرات.

اترك الأنبوب على الماء المغلي لمدة خمس دقائق. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 18 ، 000 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. مباشرة بعد الطرد المركزي ، انقل 10 ميكرولترات من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد يحتوي على 40 ميكرولترا من مزيج PCR الرئيسي.

بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتنقية المنتج المضخم شبه الأساسي 432 باستخدام جين cII والمناطق المجاورة له المدمجة باستخدام مجموعة تنقية PCR. ثم تسلسل الجينات المعدلة وراثيا cII باستخدام محلل الحمض النووي للكشف عن الطفرات. يمكن رؤية اللويحات التي تم الحصول عليها في كل من الألواح عيار 20 و عيار 100 بوضوح من خلال تثبيتها بجوار صندوق إضاءة أبيض وعلى خلفية داكنة.

هنا ، تصور مخطط الشريط فاعلية الطفرات لمختلف المواد الكيميائية في المركبات الفيزيائية التي تم اختبارها. يتم ذلك من خلال تحليل مدى الزيادة في التردد المتحور النسبي cII المعزول من انفجارات الألياف الجنينية للفأر. يصور مخطط الشريط كل كواشف الاختبار هذه التي تظهر زيادة ذات دلالة إحصائية في التردد الطافرة cII.

بعد ذلك ، يتم توضيح أطياف الطفرات للجين المعدل cII في انفجارات الألياف الجنينية للفأر المشعة بالأشعة فوق البنفسجية. يظهر المخطط الدائري زيادة كبيرة في التردد النسبي للسيتيدين الفردي أو الترادفي إلى انتقال الثايميدين في ثنائي النوكليوتيدات البيريميدين عند مقارنتها بعنصر التحكم. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثماني إلى عشر ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، باستثناء أوقات التحضير للوحة الخط البكتيري في الزراعة.

في تسلسل الحمض النووي ، بعد تسجيل طفرات cII. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل الطفرات لمركب الاختبار في نظام نموذج في المختبر.