النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة مثل كيفية تصرف الخلايا المناعية بالضبط في سياق ذي صلة من الناحية الفسيولوجية مثل كيفية البحث عن الخلايا المستهدفة بكفاءة في بيئة ثلاثية الأبعاد. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في توليد لوح ضوئي رفيع جدا لإضاءة المستوى البؤري فقط دون التأثير على الخلايا خارج المستوى. يتيح ذلك سرعة اكتساب سريعة جدا مع تقليل واضح في التبييض والسمية الخلوية الضوئية.

سيوضح هذا الإجراء الدكتور رينبينغ تشاو ، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء ، تحت غطاء زراعة الخلايا ، قم بنقل 400 ميكرولتر من محلول مخزون الكولاجين المبرد إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل. أضف ببطء 50 ميكرولترا من 10X PBS المبرد.

ثم امزج المحلول عن طريق إمالة الأنبوب برفق. أضف 48 ميكرولترا من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار إلى محلول الكولاجين لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 إلى 7.6. استخدم شرائط اختبار الأس الهيدروجيني لتحديد قيمة الأس الهيدروجيني للخليط.

أضف ميكرولترين من الماء المقطر المقطر المنزوع الأيونات ليصل الحجم النهائي إلى 500 ميكرولتر. تخلط جيدا وتخزن محلول الكولاجين على الثلج أو على درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. بعد وضع العلامات الفلورية على الخلايا الحية وفقا لبروتوكول النص ، تحت غطاء مزرعة الخلية ، انقل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السادسة إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر.

جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 200 مرة جم لمدة ثماني دقائق. ثم تخلص من المادة الطافية واستخدم 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع لإعادة تعليق الحبيبات. أضف 85.9 ميكرولتر من محلول الكولاجين المحايد إلى معلق الخلية واخلطه بشكل صحيح للوصول إلى تركيز الكولاجين البالغ 2.5 ملليغرام لكل ملليلتر.

اترك مزيج الكولاجين الخلوي على الثلج في الغطاء. بعد ذلك ، أدخل مكبسا في الشعيرات الدموية المطابقة حتى يخرج المكبس ملليمترا واحدا من الشعيرات الدموية. ثم بلل المكبس عن طريق الغمس في وسط الاستزراع.

يمكن أن يؤدي تخطي هذه الخطوة إلى إدخال فقاعات هواء غير مرغوب فيها بين المكبس ومصفوفة الكولاجين. اغمس الشعيرات الدموية في خليط الكولاجين الخلوي واسحب المكبس ببطء للخلف من 10 إلى 20 ملم. ثم باستخدام زجاجة رذاذ تحتوي على 70٪ من الإيثانول ، بلل منشفة ورقية واستخدمها لمسح الجدار الخارجي للشعيرات الدموية لإزالة محلول الكولاجين المتبقي.

استخدم الآن طين النمذجة لتركيب الشعيرات الدموية على الجدار الداخلي لأنبوب سعة خمسة ملليلتر. ادفع مزيج الكولاجين الخلوي إلى حافة الشعيرات الدموية. ثم احتضان الأنبوب مع الشعيرات الدموية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة لبلمرة الكولاجين.

بعد الحضانة ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من وسط الثقافة إلى الأنبوب. ثم طرد قضيب الكولاجين المبلمر بحذر إلى الوسط حتى يتدلى نصف الكولاجين تقريبا في الوسط. احتضان الشعيرات الدموية لمدة 30 دقيقة أخرى.

لإجراء الفحص المجهري للصفائح الضوئية ، قم بتجميع غرفة العينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد تشغيل المجهر والحاضنة في حالة إجراء التصوير المباشر ، ضع الشعيرات الدموية في غرفة العينة ، وحدد موقع العينة ، وابحث عن منطقة الاهتمام للحصول على الصورة. قم بتنشيط الليزر المقابل.

ثم اضبط قوة الليزر ووقت التعرض. قم أيضا بتعيين حجم خطوة مكدس Z ومواضع البداية والنهاية لمكدس Z والفاصل الزمني لتصوير الخلايا الحية. ثم ابدأ الحصول على الصورة.

انقل ملليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS إلى أنبوب خمسة ملليلتر تحت غطاء كيميائي. ثم اغمس الشعيرات الدموية بالكولاجين المبلمر في محلول بارافورمالدهيد واستخدم طين النمذجة لتركيب الشعيرات الدموية على الجدار الداخلي للأنبوب. اضغط برفق على المكبس حتى يتدلى نصف قضيب الكولاجين في محلول بارافورمالدهايد.

ثم اسحب المكبس للخلف لأخذ قضيب الكولاجين مرة أخرى إلى الشعيرات الدموية. قم بإزالة الشعيرات الدموية من الأنبوب وتخلص من بارافورمالدهايد. قم بتركيب الشعيرات الدموية في أنبوب جديد وأضف ملليلتر واحد من PBS.

تأكد من غمر الشعيرات الدموية في PBS. اضغط برفق على المكبس حتى يتدلى نصف قضيب الكولاجين في المحلول واحتضانه لمدة خمس دقائق. اسحب المكبس للخلف لأخذ قضيب الكولاجين في الشعيرات الدموية.

ثم استبدل PBS ب PBS الطازج وطرد قضيب الكولاجين في المحلول. بعد الغسيل الثالث ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من المخزن المؤقت للنفاذية في الأنبوب. طرد قضيب الكولاجين في المحلول واحتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

استبدل المخزن المؤقت للنفاذية الحجب ب 200 إلى 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في حجب المخزن المؤقت للنفاذية واحتضان قضيب الكولاجين المغمور في المحلول لمدة ساعة واحدة. بعد استخدام PBST لغسل قضيب الكولاجين ثلاث مرات ، احتضان القضيب في الأجسام المضادة الثانوية في منع المخزن المؤقت للنفاذية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ثلاث غسلات أخرى في PBS ، اسحب قضيب الكولاجين مرة أخرى إلى الشعيرات الدموية واحتفظ بالعينة في PBS حتى التصوير.

كما رأينا في هذا الفيلم ، أثناء الهجرة ، شكلت خلايا CTL المنقولة ببروتين اندماج الأكتين EGFP نتوءات رئيسية على شكل ليمون ، مهدبة بهياكل دقيقة تشبه المغزل. يتم توضيح مسارات CTLs هنا بالسرعة والثبات أو الإزاحة مقسومة على طول المسار الكلي كمعلمات مقاسة. تتراوح السرعات من 0.01 إلى 0.19 ميكرون في الثانية بفارق 20 ضعفا تقريبا ويتراوح الثبات من صفر إلى 0.7.

يوضح هذا الشكل خلايا CTL الثابتة في هلام الكولاجين ثلاثي الأبعاد الملون بالبيرفورين -1 الداخلي والأكتين. كانت العينة مضاءة من جانب واحد أو من كلا الجانبين. من مواضع Z المختلفة ، يتم تلطيخ الخلايا بالتساوي مما يشير إلى اختراق جيد للأجسام المضادة في المواد الهلامية للكولاجين.

أظهر CTL الثابت نفس التشكل مثل الخلايا الحية مما يشير إلى أن التشكل يتم صيانته جيدا مع هذا البروتوكول. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا أن تتذكر تجنب فقاعات الهواء وضبط قيمة الأس الهيدروجيني بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلطيخ الخلايا الحية بجزيئات سطحية معينة للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية ربط سلوك الخلية بالتمايز أو مع أنواع فرعية مختلفة من الخلايا أو للتحقيق في تفاعل الخلية ومصير الخلية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية وعلم المناعة وأبحاث السرطان لاستكشاف سلوك الخلية ومصير الخلية والتمايز وتفاعل الخلايا في النظام الأكثر صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينات بالخلايا المضمنة في مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد ، وكيفية تصور العينات باستخدام الفحص المجهري للصفائح الضوئية ، سواء كانت حية أو ثابتة ، وكيفية تتبع هجرة الخلايا ثلاثية الأبعاد.