الكشف عن الأجسام المضادة التي تحييد استيعاب الخلوية لأنزيم استبدال العلاجات مع تحليل يستند إلى الخلية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات المناعة والتحليل الحيوي حول تأثير تحييد الأجسام المضادة على سلامة الأدوية وفعاليتها وملامح الحرائك الدوائية والديناميكية الدوائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة حساسة وذات صلة بيولوجيا قائمة على الخلايا لقياس الأجسام المضادة المعادلة الخاصة بالأدوية بطريقة شبه كمية. في هذه التقنية ، تدخل الإنزيمات المسماة بالفلوروفور إلى خلايا جوركات من خلال ارتباط بقايا مانوز 6 فوسفات بمستقبلات مانوز 6 فوسفات المستقلة عن الكاتيون أو CI-M6PR.

الأجسام المضادة المعادلة التي تمنع تفاعل مستقبلات الإنزيم إلى انخفاض في التألق كما تم قياسه بواسطة قياس التدفق الخلوي. للبدء ، قم بالبذور 7.5 في 10 إلى خلايا جوركات الرابعة في 100 ميكرولتر من وسط نمو الخلية لكل بئر في صفيحة زراعة خلية مستديرة من 96 بئرا لحضانة من 14 إلى 20 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع 95٪ رطوبة. خفف عينات الفحص في وسط خال من المصل أولا بنسبة واحد إلى 2.5.

ثم أضف 60 ميكرولترا من كل عينة إلى الآبار المناسبة للوحة بولي بروبيلين بيضاء مستديرة القاع غير ملزمة ذات 96 بئرا. ستكون هذه لوحة حضانة العينة. بالنسبة للعينات التي تم فحصها بشكل إيجابي وتحتاج إلى تأكيد ، قم بتدوير قارورة من العلاج باستبدال الإنزيم أو حبات ERT وأضف العدد المناسب من الخرزات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر لدوامة أخرى.

ثم ضع الأنبوب في رف أنبوب مغناطيسي لمدة دقيقتين وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. بعد الغسيل الرابع ، أضف 100 ميكرولتر من الخرز إلى الآبار المناسبة للوحة بولي بروبيلين بيضاء جديدة ذات قاع دائري غير ملزم. عندما يتم طلاء جميع الخرزات ، ضع اللوحة على مغناطيس جانبي 96 جيدا واترك الخرزات تشكل حبيبات قبل إزالة المادة الطافية الشفافة بعناية.

بعد ذلك ، أضف 140 ميكرولترا من كل عينة في الآبار المناسبة وأغلق اللوحة بغشاء بلاستيكي للاهتزاز لمدة 60 دقيقة على الأقل على شاكر دوار عند حوالي 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع اللوحة التأكيدية على المغناطيس ذو التفاف الجانبي المكون من 96 بئرا للسماح للخرز بتكوين حبيبات أخرى وإضافة 60 ميكرولترا من العينة إلى الآبار المناسبة للوحة حضانة عينة البولي بروبلين ذات القاع الأبيض غير الملزمة ذات القاع المستدير المكونة من 96 بئرا. بالنسبة للعينات التي تم فحصها وتأكد إصابتها ، يمكن إجراء سلسلة عيار.

لتحضير سلسلة عيار ، قم بتخفيف العينة بشكل متسلسل في المصفوفة المجمعة لعدد كاف من المرات لعبور نقطة قطع العيار المحددة مسبقا وإضافة 60 ميكرولترا من كل عينة مخففة إلى الآبار المناسبة للوحة حضانة العينة و 60 ميكرولترا من التركيزات المناسبة من ERT المسمى بالفلوروفور إلى الآبار المناسبة للوحة البولي بروبيلين الجديدة ذات القاع المستدير الأبيض غير الملزمة ذات القاع الدائري 96 بئرا وفقا لبروتوكول النص. ثم قم بتقطيع محلول عينة ERT الفلوروفوري عدة مرات لخلط الألواح ولفها بورق الألمنيوم لمدة 14 إلى 20 ساعة عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتسخين ألواح العينة في حمام حبة 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة وفحص الخلايا المطلية على مجهر مقلوب للتأكد من أن الخلايا سليمة وموزعة بالتساوي عبر الآبار.

عندما ترتفع درجة حرارة الصفائح ، أضف 100 ميكرولتر من العينة وخليط ERT المسمى بالفلوروفور إلى لوحة الخلية وفقا لخريطة اللوحة التجريبية وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاث ساعات و 15 دقيقة أخرى. في نهاية الحضانة ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتأكد من وجود حبيبات في قاع كل بئر. أمسك اللوحة بزاوية 30 إلى 45 درجة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية في كل بئر دون إزعاج الكريات وغسل الخلايا ثلاث مرات في 200 ميكرولتر من DPBS لكل بئر لكل طرد مركزي.

بعد الغسيل الأخير ، أضف 100 ميكرولتر من البقعة الميتة الحية إلى كل بئر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. في نهاية الحضانة ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من DPBS لكل بئر. أعد تعليق الكريات المغسولة في 100 ميكرولتر من درجتين إلى ثماني درجات مئوية 1٪ بارافورمالدهايد لكل بئر وأغلق اللوحة لدوامة النبض اللطيفة.

ثم لف الطبق بورق الألمنيوم لمدة 10 دقائق عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية. لتحليل صلاحية الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، امزج الخلايا مع 50 ميكرولترا من DPBS لكل بئر لتحقيق تعليق خلية واحدة وقراءة الخلايا على مقياس التدفق الخلوي وفقا لبروتوكولات قياس التدفق الخلوي القياسية. يمكن بعد ذلك تقييم امتصاص ERT المترافق بالفلوروفور وفقا لمتوسط شدة التألق أو MFI للخلايا المفردة الحية.

قبل الاختبار في الفحص ، يتم حساب نقطة قطع الفحص التجريبية كعتبة لتحديد العينات الإيجابية والسلبية. في هذا المثال ، يتم عرض ضوابط الجودة التي تم رفعها بكميات عالية أو منخفضة من الأجسام المضادة المعادلة. ثم يتم اختبار العينات الإيجابية في اختبار تأكيدي باستخدام حبات مغناطيسية مترافقة بالمخدرات لاستنفاد الجسم المضاد الخاص بالدواء من العينات.

العينات التي تحتوي نسبة الاسترداد أكبر من نقطة القطع التأكيدية موجبة. يتم تخفيف العينات التي تم فحصها والتأكد من إصابتها بشكل متسلسل واختبارها في مقايسة العيار لتحديد العيار النسبي للأجسام المضادة المعادلة في كل عينة. العيار هو القيمة المقحمة بين مخففين يعبران نقطة قطع العيار.

كما هو موضح هنا ، قامت مؤسسات التمويل الأصغر أحادية الخلية الحية بتقييم امتصاص ERT المترافق بالفلوروفور. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، ارتفعت المصفوفة مع الجسم المضاد للتحكم الإيجابي تثبط امتصاص ERT المترافق بالفلوروفور مما أدى إلى انخفاض متوسط شدة التألق. في المقابل ، أظهرت الخلايا المحتضنة بالمصفوفة في غياب الجسم المضاد للتحكم الإيجابي متوسطة شدة مضان أعلى مما يدل على امتصاص ERT المترافق بالفلوروفور.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على نوافذ حضانة صارمة للحصول على نتائج موثوقة ومتسقة. من المهم أيضا تحسين الفحص لكل علاج ببدائل الإنزيم. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء المناعة والتحليل الحيوي في تطوير الأدوية لاستكشاف تأثير الأجسام المضادة المعادلة لامتصاص الخلايا على سلامة وفعالية ERT.

لا تنس أن العمل مع العينات البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن جميع العينات يجب أن تعامل كما لو كانت معدية أثناء إجراء هذا الإجراء.