تحليل وظيفة خلايا بيتا باستخدام تصوير الكالسيوم القرار خلية واحدة في الجزيرات الزرد

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم الأسئلة المهمة في مجال خلايا بيتا. مثل وظيفة تكنولوجيا المعلومات غير المتجانسة بين خلايا بيتا الفردية داخل جزيرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الدقة المكانية والزمانية التي يوفرها التصوير الحي لخلايا بيتا.

يمكننا التقاط تذبذبات الكالسيوم داخل خلايا بيتا الفردية. بعد القتل الرحيم للسمكة وفقا لبروتوكول النص ، قم بنقلها إلى طبق بتري يحتوي على محلول HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم تحت مجهر ستيريو مزود بمصباح مضان ومكعب مرشح أحمر ، استخدم ملقطا حادا لقطع الجلد من الفم إلى الزعنفة الشرجية.

قشر الجلد المقطوع على الجانب الأيمن لكشف البطن ، مما يؤدي إلى كشف الأعضاء الداخلية. ثم باستخدام التألق الأحمر لتحديد mKO2 التعبير في خلايا بيتا ، حدد موقع الجزر. نظف الجزيرة الأولية عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة بعناية ، مثل الكبد والخلايا الشحمية.

اتخذ الاحتياطات اللازمة لعدم إصابة الجزيرة أو كزها. بعد ذلك ، ضع الماصة قطرة 30 ميكرولتر من HBSS في وسط طبق زجاجي القاع. ثم انقل الجزيرة التي تم تشريحها إلى القطرة.

باستخدام HBSS ، اغسل الجزيرة بعناية مرة واحدة ثم استخدم 30 ميكرولترا من محلول عمل الفيبرينوجين لغسلها مرة واحدة. تجنب تجفيف الجزيرة أثناء خطوات الغسيل مما قد يؤدي إلى موت الخلايا. أضف ببطء وبلطف 10 ميكرولتر من 10 وحدات لكل مليلتر من محلول الثرومبين إلى الجزيرة.

اترك الجزيرة والطبق دون أن يمسها لمدة 15 إلى 20 دقيقة. لاحظ أن قطرة الثرومبين الفيبرينوجين ستصبح لزجة ومستقرة. يجب إعطاء وقت كاف لبلمرة الثرومبين في محلول الفيبرينوجين.

وإلا فلن يوفر القالب الاستقرار أثناء جلسة التصوير. لإجراء تصوير مباشر خارج الجسم الحي لمضان GCaMP ، أضف 200 ميكرولتر من HBSS أعلى القالب وضع الطبق بعناية على حامل لوحة المجهر متحد البؤر. ثم باستخدام هدف خطأ NA 20X 0.8 وخيار المجال الساطع ، حدد موقع الجزيرة.

استخدام مرشح التألق الأحمر لعرض مضان mKO2 النووي في خلايا بيتا يركز على الجزيرة. يجب أن تكون النوى الفردية مرئية بوضوح. حدد موقع مستوى تصوير واضح عن طريق التحرك يدويا عبر سمك الجزيرة على طول محورها Z.

تأكد من أن مستوى التصوير يحتوي على 50 إلى 100 خلية بيتا للتصوير وأن سطوع مضان mKO2 النووي موحد ، خاصة في وسط الجزيرة. بعد ذلك في قائمة الإعداد الذكي، قم بإعداد عملية استحواذ متسلسلة لمضان GCaMP6 و mKO2 باستخدام الإعدادات التالية. بالنسبة ل GCaMP6 ، اختر إثارة 488 نانومتر وانبعاث تقريبي من 500 إلى 555 نانومتر.

تحت اللون الزائف، حدد GFP. بالنسبة إلى mKO2 اختر إثارة 561 نانومتر وانبعاث من 570 إلى 630 نانومتر. بالنسبة للون الزائف، حدد mCherry.

في وضع الاكتساب ، اضبط دقة الصورة على 1 ، 024 × 1 ، 024 بكسل ، والسرعة على 10 ، والمتوسط إلى واحد. ابدأ التسجيل المستمر عن طريق تحديد خيار السلسلة الزمنية وتعيين المدة على 500 دورة مع وقت اكتساب ثانيتين تقريبا لكل إطار. راقب دورة التصوير.

بعد أول 50 إطارا دون إزعاج اكتساب الصورة ، قم بسحب خمسة ميكرولترات من محلول D-glucose 200 مللي مولار برفق أعلى الجل الذي يحمل الجزيرة. ثم احصل على 150 إطارا عند 10 مللي مولار جلوكوز. تتوافق أول 50 إطارا من السلسلة الزمنية مع نشاط خلايا بيتا عند خمسة مللي مولار جلوكوز.

هذا هو النشاط الأساسي. ستظهر خلية بيتا المستجيبة إزالة الشعر بالشمع وتضاؤل التألق الأخضر بمرور الوقت. عند 200 إطار ، قم بزيادة تركيز الجلوكوز إلى 20 ملليمولار عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 200 مللي مولار D-glucose.

ثم احصل على 150 إطارا بتركيز 20 ملليمول. لفتح ملف الصورة في FIJI، حدد البرنامج المساعد، LSM Toolbox، إظهار LSM Toolbox. في مربع أدوات LSM، انقر فوق Open LSM وحدد ملف الصورة.

ضمن أدوات، في القائمة تحليل، افتح مدير عائد الاستثمار. باستخدام أداة تحديد المضلع الموجودة في شريط الأدوات، ارسم عائد الاستثمار يدويا. ارسم عائد الاستثمار في القناة الحمراء بحيث يغطي مساحة أكبر من النواة لتشمل بعض سيتوبلازم الخلية.

تأكد من أن موضع عائد الاستثمار متسق بين الإطارات واضبط الموضع إذا لزم الأمر. أضف عائد الاستثمار المحدد إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق الزر إضافة. حدد وأضف عائد استثمار متعدد للحصول على بيانات على خلايا متعددة.

بعد ذلك من قائمة التحليل، حدد تعيين القياسات. ثم حدد الكثافة المتكاملة لتحديد استخراج شدة التألق الكلية داخل المنطقة. قم بالتبديل إلى القناة الخضراء التي تحتوي على مضان GCaMP وفي مدير العائد على الاستثمار حدد قياس متعدد.

سيوفر هذا قياسات الشدة للخلايا طوال السلسلة الزمنية. احفظ إخراج FIJI كملف نصي مفصول بفواصل. من LSM Toolbox، احصل على الطوابع الزمنية لإطارات الصور.

استخدم تطبيق الطوابع ، وتطبيق طوابع t ، واسم الملف ، والتفريغ إلى ملف نصي ، للحصول على الطوابع الزمنية. احفظ الطوابع الزمنية باستخدام خيار حفظ باسم أو انسخها في جدول البيانات. عند تجميع قيم الشدة لجميع الخلايا ، قم بإجراء التحليل خلية واحدة في كل مرة أو تلقائيا.

راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل إضافية. في هذه التجربة ، تم تحفيز خلايا بيتا الأولية الفردية من 45 خط معدل وراثيا DPF يعبر عن mKO2 و GCaMP6 النووي على وجه التحديد في خلايا بيتا ، باستخدام منحدر الجلوكوز ثم إزالة الاستقطاب بكلوريد البوتاسيوم. تم تحليل نشاط الخلايا.

باستخدام FIJI وبرنامج تحليل البيانات ، تم استخراج شدة مضان GCaMP6 لخلايا بيتا الفردية وتطبيعها. كما يتضح من هذا الأثر لشدة التألق ، تظهر خلايا بيتا الفردية تذبذبات في مضان GCaMP6 عند تحفيزها بالجلوكوز ، وإضافة كلوريد البوتاسيوم تعمل على استقرار التألق. توفر هذه التقنية دقة خلوية لاستجابة الجلوكوز في خلية بيتا ونافذة على وظائفها.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في 45 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم التحقق من صلاحية خلايا بيتا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التلاعب الجيني ، لفهم دور جينات معينة في وظيفة خلايا بيتا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس استجابة الجلوكوز داخل خلايا بيتا الفردية.