أزرق تولويدين تلطيخ أبواب جزءا لا يتجزأ من الراتنج للتقييم مورفولوجيا الأعصاب الطرفية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات إصابة الأعصاب الطرفية وتجديدها مثل ما هو قياس المورفومية للعصب المحيطي ، وكم عدد المحاور العصبية الموجودة ، وما هي حالة تكوين النخاع ، وهل يوجد نسيج ليفي؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتصور عالي الدقة للميزات العصبية. ابدأ بوضع فأر مخدر في وضع الانبطاح أعلى حصيرة التشريح.

ضع مخروط الأنف للحفاظ على التخدير مع 1-2٪ إيزوفلوران. لضمان عمق التخدير الكافي ، اختبر بحثا عن انسحاب الدواسة وردود الفعل الجفنية للقدمين الخلفيتين. بمجرد تحقيق عمق مناسب للتخدير ، احلق شعر الأطراف الخلفية وقم بتعقيم المناطق المحلوقة بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ملامسة عظم الفخذ لتحديد الموقع المناسب للشق. يقع عظم الفخذ بالقرب من الجزء الأكثر سهولة من العصب الوركي. بعد إجراء شق من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات في الجلد على طول الطرف الخلفي من الركبة إلى المدور الأكبر ، حدد موقع المستوى بين العضلة ذات الرأسين والعضلة الفخذية والعضلة الألوية الكبرى.

ثم استخدم مقص التشريح المجهري لفصل اللفافة الأساسية وتعريض سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات من العصب الوركي الأساسي. استخدم ضام لتوسيع الفجوة بين العضلات. باستخدام ملقط دقيق ومقص قزحية العين ، افصل العصب بعناية عن النسيج الضام المحيط ، مع الحرص الشديد على عدم ضغط العصب أو قطعه.

بعد ذلك ، قم بتغطية العصب المكشوف بمثبت ترامب واتركه لمدة 10 دقائق. إذا لزم الأمر ، ضع الشاش تحت الساق الخلفية لتحسين الزاوية بحيث يمكن إضافة المزيد من المثبت في التجويف. قم بإزالة المثبت بعد 10 دقائق وكرر هذه الخطوة مرتين أخريين.

تحت مجهر التشريح ، قم بقطع العصب الوركي من كلا الجانبين باستخدام مقص تشريح دقيق ، مع التأكد من عدم شد العصب أو قرصه. ضع الأقسام العصبية على الفور في أنابيب سعة 15 مل تحتوي على مثبت ترامب وثبتها عند أربع درجات مئوية لمدة أسبوع واحد ، مع تغيير المثبت كل 48 ساعة. بعد التثبيت ، قم بإزالة أي دهون وأنسجة ضامة متبقية بعناية من العصب ، واستخدم مشرطا حادا لتقطيع العصب إلى شرائح يبلغ طولها حوالي خمسة ملليمترات.

يمكن فصل الأجزاء العصبية إلى أنابيب مختلفة ذات مسماة. اغمر الأجزاء العصبية في 2٪ من رابع أكسيد الأوزميوم المحضر حديثا لمدة ساعتين. باستخدام مجموعة تضمين الإيبوكسي ، قم بإعداد خليط التضمين النهائي.

امزج وسط تضمين الإيبوكسي مع محلول DDSA واخلط وسط تضمين الإيبوكسي مع محلول NMA. امزج كلا المحاللين لمدة 20 دقيقة على الأقل باستخدام محرك مغناطيسي. قبل الاستخدام مباشرة ، اجمع المسرع DPM مع الحل B ثم اجمعه مع الحل A بحيث تكون النسبة النهائية للمسرع بين نقطة واحدة وخمسة و 2٪ من الحجم الإجمالي.

انقل الأجزاء العصبية إلى نقطة واحدة خمسة أنابيب ملليلتر وبعد الغسيل باستخدام PBS ، ابدأ عملية الجفاف عن طريق استبدال PBS بتركيزات متزايدة من الأسيتون والماء المقطر لمدة 10 دقائق لكل منهما ثم في 100٪ الأسيتون ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. إحدى الخطوات الحاسمة هي جفاف الأنسجة. لن يتفاعل الماء والراتنج ، لذلك لن يتم اختراق أي ماء متبقي في الأنسجة بواسطة الراتنج مما يترك ثقوبا في القسم خالية من الصفات النسيجية.

لتسلل الراتنج ، ضع أولا الأجزاء العصبية في مزيج فردي من خليط التضمين والأسيتون بنسبة 100٪ لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، انقل الشرائح إلى مزيج اثنين إلى واحد من خليط التضمين و 100٪ الأسيتون لمدة 30 دقيقة. ضع فواصل الأعصاب في قوالب تضمين مطاط السيليكون وأضف الراتنج برفق فوق الأعصاب ، مع التأكد من تغطية الجزء العصبي بالكامل مع تجنب فقاعات الهواء.

اترك الراتنج يتبلمر عند 60 درجة مئوية طوال الليل. ضع كتلة من الراتنج مع عصب مدمج في حامل الميكروتوم الفائق بحيث يكون الجانب شبه المنحرف متجها لأعلى. أثناء المشاهدة من خلال منظار الميكروتوم الفائق ، استخدم شفرة ذات حافة واحدة لتقليم الراتنج الزائد المحيط بالأنسجة العصبية.

لا تخترق السطح الطولي للجزء العصبي الذي يمكن التعرف عليه من خلال تلطيخه الداكن بواسطة رابع أكسيد الأوزميوم. باستخدام سكين زجاجي عادي على الميكروتوم الفائق ، قم بعمل مقاطع عرضية متعددة لفضح سطح مقطع عرضي موحد للعصب. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بالتبديل إلى سكين زجاجي مع القارب المملوء بالماء المقطر في درجة حرارة الغرفة واضبط الميكروتوم الفائق على ميكرون إلى ميكرون لقطع الأجزاء الرقيقة.

استخدم حلقة معدنية لنقل الأجزاء الرقيقة العائمة من قارب السكين الزجاجي إلى قطرة من الماء منزوع الأيونات على شريحة زجاجية. خطوة أخرى حاسمة هي أثناء نقل القسم الرقيق من السكين الزجاجي إلى الانزلاق. هذه الأقسام الرقيقة هشة للغاية ويمكن أن تنكسر أو تطوى.

بعد التقسيم ، جفف الأقسام الموجودة على الشرائح عن طريق تمرير شريحة فوق اللهب عدة مرات ، مع التأكد من عدم ارتفاع درجة حرارة الأقسام. يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام إذا لم يتم تلطيخها على الفور باللون الأزرق التولويدين. لتلطيخ الأقسام العصبية، استخدم ماصة بلاستيكية أو ماصة دقيقة لإضافة قطرة من محلول التولودين الأزرق في الجزء العلوي من الأجزاء العصبية.

بعد 20 إلى 30 ثانية ، اشطف كل محلول تولويدين الأزرق الزائد عن طريق غمس الشرائح برفق في وعاء من الماء منزوع الأيونات ، وكرر ذلك ثلاث إلى أربع مرات حتى تصبح الأقسام واضحة. جفف الشرائح لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 60 درجة مئوية أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد التجفيف ، أضف وسط التثبيت العادي وقم بتغطية الأقسام بغطاء.

أخيرا ، افحص الأقسام المثبتة تحت المجهر الضوئي. يوصى باستخدام عدسة غمر بالزيت بمعدل 100X للحصول على صور مفصلة لحساب نسب g. أظهرت أقسام العصب الوركي المضمنة في وسط الراتنج والملطخة باللون الأزرق التولودين صورا واضحة بدقة مثالية عند زيادة التكبير من 10X إلى 20X و 40X و 60X.

تحافظ هذه الطريقة على بنية الأعصاب وتسمح بتصوير عالي الدقة وعالي التكبير مما يسهل قياس العديد من المعلمات مثل نسبة g ، وهي نسبة قطر المحور العصبي ، المشار إليها بالسهم المسمى B ، إلى إجمالي قطر الألياف ، المسمى A. يمكن أن تؤدي مجموعة متنوعة من العوامل إلى أقسام أعصاب محيطية أقل من المثلى ، بما في ذلك وجود تشققات في القسم بسبب التعامل غير السليم مع العصب. يمكن أن تحدث ثقوب أيضا في القسم بسبب عدم كفاية الجفاف. خطأ آخر محتمل في الإجراء هو طي الأقسام ، والتي يمكن معالجتها باستخدام حلقات التلقيح لنقل القسم على الشريحة الزجاجية.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل القياس الكمي للمحور العصبي للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي درجة التجديد في العصب المتجدد؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على قسم من واحد إلى اثنين من أقسام الأعصاب الطرفية لتقييم مورفومتري الأعصاب.