Name: قياس التدفق الخلوي التصويري لدراسة التجميع الذاتي الميكروبي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: اكتشف تحليل التدفق الخلوي التصويري لدراسة التجميع الذاتي الميكروبي في بكتيريا Lactobacillaceae. يوضح هذا البروتوكول كيفية قياس استجابة التجمعات للكربوهيدرات الغذائية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة 119/16) ومنحة IMoh (3-15656) إلى IKG. R.S. بدعم من زمالة كريتمان.

يتم توفير ملف .ast ، مع قالب Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) كمثال ، في ملف الترميز التكميلي 1.
1. إعداد وسائل الإعلام
<ol><li>تحضير مرق العصيات اللبنية MRS باتباع تعليمات الشركة المصنعة (55 جم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات) وألواح أجار Lactobacilli MRS مع 1.5٪ (وزن / حجم) أجار (انظر جدول المواد). بعد تعقيم الأوتوكلاف ، يكون الوسيط جاهزا للاستخدام مباشرة أو يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تحضير 50٪ (15 جم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات) مرق الصويا التربتيك (TSB) (انظر جدول المواد) ، TSB مكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - جلوكوز و 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - رافينوز ، ثم الأوتوكلاف لتعقيم الوسط. يفضل تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لتجنب التلوث.</li>
	<li>بالنسبة للوسط المخزن مع الجلوكوز، قم بإعداد TSB المكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - جلوكوز ، و 5 mM من فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة مع ثنائي القاعدة البوتاسيوم ، و 100 mM MOPS (3- (N-morpholino) حمض البروبان السلفونيك ، انظر جدول المواد) الرقم الهيدروجيني 7. ثم الأوتوكلاف لتعقيم الوسط.</li>
</ol>2. إعداد العينات
ملاحظة: تتضمن هذه الخطوة تقييم التجميع الخلوي استجابة للسكر القابل للتخمير أو غير القابل للتخمير من نظامنا الغذائي. يوضح الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا لعملية تحضير العينة.
<ol><li>قم بخط سلالة Lactobacillaceae من مخزون الجلسرين المجمد (50٪ جلسرين) على طبق مرق Lactobacilli MRS (1.5٪ أجار). ملاحظة: في المثال التجريبي المقدم هنا ، تم استخدام سلالات بروبيوتيك Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356) و Lacticaseibacillus casei (ATCC 393) و Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52) و Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) و Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). لتوسيع هذه المنهجية لتشمل أعضاء بروبيوتيك إضافيين من شعبة firmicutes ، تم اختيار Bacillus coagulans (ATCC 10545).</li>
	<li>تنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة.</li>
	<li>تلقيح 5 مل من مرق MRS العصيات اللبنية بمستعمرة واحدة وزراعتها عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة طوال الليل.</li>
	<li>تمييع ثقافة الخلية من الخطوة السابقة (1: 100) في 3 مل من 50٪ مرق الصويا التربتي (TSB) ، TSB المكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - جلوكوز ، أو TSB مكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - رافينوز.</li>
	<li>احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة.</li>
	<li>قم بإعداد العينة عن طريق خلط الخلايا بشكل موحد في الوسط ، ودوامة أنبوب زراعة الخلية برفق من الخطوة 2.5. اقلب أنبوب الاختبار برفق حتى يتم الخلط الكامل. نقل 200-300 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل. ملاحظة: من الضروري عدم صوتنة العينة لتجنب كسر الركام. أثناء الحصول على البيانات من الخطوات 3.4 إلى 3.10 ، قد تكون هناك حالات تكون فيها العينات مركزة للغاية. إذا لوحظ أن العينة تعمل ببطء شديد أو لا تعمل على الإطلاق ، يمكن للمرء أن يخفف العينة باستخدام الوسط الطازج المناسب.</li>
</ol>3. الحصول على البيانات
<ol><li>قم بإعداد مقياس تدفق التصوير الخلوي وفقا للإرشادات المقدمة من الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).</li>
	<li>اضبط ليزر 785 نانومتر على 5 ميجاوات لقياس الحقل المظلم (أي ما يعادل التشتت الجانبي في قياس التدفق الخلوي التقليدي ، والمختصر باسم SSC). استخدم عدسة 60x بفتحة عدسة رقمية (N.A) تبلغ 0.9 ، وحدد حساسية عالية ، واضبط السرعة على منخفضة.</li>
	<li>قبل جمع أي بيانات ، تأكد من استقرار تدفق حبات المعايرة في قناة SSC. انقر فوق زر التشغيل في مربع "fluidics" وافحص جودة صور الخرزة. يجب أن تظهر صور الخرزة حادة ونقية.</li>
	<li>اضغط على زر التحميل وضع أنبوبا به عينة (من الخطوة 2.6) في الحامل.</li>
	<li>قم بإنشاء مخطط تشتت جديد في مربع "مساحة العمل". انقر فوق مخطط تشتت جديد وحدد المنطقة في قناة برايت فيلد المقابلة لشدة قناة SSC. استبعد حبات المعايرة التي تعمل في الجهاز مع العينة. ملاحظة: يمكن استبعاد الخرز عن طريق تحميل عينة مع المخزن المؤقت فقط وتحديد الخرز على المنطقة مقابل. مؤامرة SSC. ثم ارسم بوابة حول مجموعة الخرزات باستخدام زر إنشاء منطقة مضلعة .</li>
	<li>في مربع "إعدادات الاكتساب" ، أدخل اسم العينة ، وحدد موقع تخزين البيانات ، واختر المحتوى (جميع الخلايا بدون خرز) للتسجيل منه ، وقم بتعيين عدد الأحداث التي سيتم جمعها. عادة ما يكون 10,000-20,000 حدث كافيا.</li>
	<li>انقر فوق الزر "تسجيل " الموجود في مربع "الاستحواذ" ، وستنتهي عملية الاستحواذ تلقائيا بمجرد الوصول إلى العدد المحدد من الأحداث.</li>
	<li>انقر فوق الزر "رجوع " لتفريغ الأنبوب ، وقم بإزالة الأنبوب من الحامل عندما يطلب منك ذلك في نافذة صغيرة.</li>
	<li>كرر الخطوات من 3.5 إلى 3.9 لكل عينة.</li>
	<li>احفظ القالب للحفاظ على توحيد الحصول على البيانات للتكرارات اللاحقة.</li>
</ol>4. تحليل البيانات
<ol><li>قياس النسبة المئوية (٪) من التجميع التلقائي من السكان.<ol><li>تحليل البيانات التي تم الحصول عليها على مقياس تدفق التصوير الخلوي باستخدام برنامج IDEAS (انظر جدول المواد).</li>
		<li>قم بإنشاء ملف تحليل بيانات (.daf) من الملف الأولي (.rif) عن طريق تحميل الملف (.rif) في برنامج التحليل. انقر فوق الزر ملف وافتح الملف المطلوب (.rif). في النافذة المفتوحة ، انقر فوق استخدام تحليل الاستحواذ ثم انقر فوق موافق.</li>
		<li>قم بإنشاء مدرج تكراري لتدرج RMS (قياس تباين الصورة والتركيز) في قناة برايت فيلد لتحديد الأحداث المركزة. في منطقة التحليل، انقر فوق الزر مدرج تكراري جديد . في نافذة "الرسم البياني الجديد" ، اختر السكان من الاستحواذ لتحليله ، وفي "ميزة المحور x" ، حدد تدرج RMS لقناة برايتفيلد.<ol><li>ضع بوابة بالنقر فوق الزر إنشاء منطقة خط في منطقة التحليل لاستبعاد الأحداث غير المركزة (الشكل 2 أ). ملاحظة: عادة ، يجب أن تتضمن منطقة الخط "المركزة" 80٪ -90٪ من الأحداث ذات أعلى درجة RMS متدرجة ، ولكن يجب تحديد عتبات محددة للخلايا "في التركيز" لكل إعداد تجريبي.</li>
		</ol></li>
		<li>قم بإنشاء مخطط مبعثر للمساحة (μm2) مقابل نسبة العرض إلى الارتفاع (العرض مقسوما على طول القطع الناقص الأكثر ملاءمة) لقناة brightfield. اضغط على زر مخطط التشتت الجديد في منطقة التحليل. في نافذة "مخطط تشتت جديد" ، اختر المحتوى المركز من الخطوة 4.1.3.<ol><li>حدد منطقة قناة برايت فيلد لميزة المحور السيني ونسبة العرض إلى الارتفاع لقناة برايت فيلد لميزة المحور ص. يسمح مخطط التشتت هذا ببوابات على السكان المركزين لتمييز الأحداث الفردية والركامية الصغيرة عن المجاميع والسلاسل الميكروبية الأكبر.</li>
		</ol></li>
		<li>في مخطط التشتت هذا ، ارسم بوابة باستخدام زر إنشاء منطقة مستطيل (أو إنشاء منطقة مضلع) بناء على قيمة المنطقة لمجتمع أحداث التجميع وبوابة أخرى لتعداد المجاميع الفردية والمجاميع الصغيرة (الشكل 2 ب). ملاحظة: في بعض الخلفيات، قد يكون فصل الركام الصغير عن المجاميع الفردية أمرا صعبا، بحيث يمكن دمجها في نفس البوابة. الأمر نفسه ينطبق على الركام والسلاسل الأكبر (الشكل 3).</li>
		<li>مراجعة وتقييم صور الأحداث يدويا داخل كل بوابة للتحقق من موثوقية استراتيجية البوابة. إذا لزم الأمر ، اضبط قيمة المنطقة للبوابة. نفذ ذلك عن طريق تحديد المحتوى الذي تمت مراجعته من القائمة المنسدلة "السكان". ملاحظة: لا تحتوي البوابة على قيمة مساحة محددة ، حيث يمكن أن تختلف اعتمادا على خصائص البكتيريا التي يتم تحليلها.</li>
		<li>احفظ تحليل البيانات كقالب. انقر فوق علامة التبويب ملف ، وحدد حفظ باسم Template.ast، وافتح نموذج الملف التالي (.rif) ضمن نفس القالب لإنشاء ملف تحليل البيانات (.daf) (دعم ملف .ast كمثال ل LGG).</li>
		<li>إنشاء جدول إحصائي لتعداد الأحداث الرئيسية لمزيد من التحليل. انقر فوق علامة التبويب التقارير ، ثم انقر فوق تحديد تقرير الإحصائيات.</li>
		<li>في النافذة الجديدة، انقر على إضافة أعمدة. أضف عدد المفردات / المجاميع والإحصاءات ٪ المسورة. ضمن "الإحصاءات"، اختر ٪gated/count، وضمن المحتوى المحدد، اختر المفردات/التجميعات. انقر فوق إضافة إحصائيات لإضافة الإحصائية إلى القائمة وحفظها كقالب.</li>
		<li>اضغط على إنشاء تقرير إحصائي واختر القالب الإحصائي وملفات (.daf) للتحليل.</li>
	</ol></li>
	<li>قياس توزيع حجم الركام.<ol><li>لتحليل متوسط حجم أحداث التجميع ، ارسم رسما بيانيا للمنطقة (μm2) لمجتمع أحداث التجميع من الخطوة 4.1.5 (الشكل 2C).</li>
		<li>احفظ تحليل البيانات كقالب. انقر فوق علامة التبويب ملف ، وحدد حفظ كقالب، وافتح نموذج الملف التالي (.rif) ضمن نفس القالب لملف تحليل البيانات (.daf).</li>
		<li>كرر الخطوات 4.1.7-4.19. بالنسبة إلى حجم المجاميع، اختر المتوسط ضمن الإحصائيات وحدد التجميعات ضمن المحتوى المحدد. ضمن الميزات، حدد منطقة قناة برايتفيلد. انقر فوق إضافة إحصائيات لإضافة الإحصائية إلى القائمة وحفظها كقالب.</li>
		<li>كرر الخطوة 4.1.9 لإنشاء تقرير إحصائي.</li>
	</ol></li>
</ol>

التحليل الكمي للتجميع الذاتي الميكروبي باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير

<ol><li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autoaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li>
<li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtaA%2C+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830(2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein%2C+Flp%2C+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li>
<li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932(2022).</li>
<li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268(2021).</li>
<li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li>
<li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+%26%2334%3BDried+Ossban%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &#34;Dried Ossban&#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607(2018).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus%3C%2Fem%3E+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li>
<li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li>
<li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli%3A+cell+aggregation+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87(2022).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285(2021).</li>
<li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host%3A+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W. Jr, Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochemica+et+Cytobiologica%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li>
<li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li>
<li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778(2021).</li>
<li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms%3A+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li>
<li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096(2021).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
</ol>

قياس التدفق الخلوي هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتحديد شدة التألق في الخلايا حقيقية النواة ، ولكنها قد لا توفر قياسات دقيقة للخلايا البكتيرية بسبب حجمها الأكبر أو مجاميعها الصغيرة. يمكن أن تؤثر هذه العوامل بشكل كبير على القياس الكمي الدقيق للتجميع الذاتي والمستوى الأساسي لتشكيل الركام في ظروف مختلفة. لمعالجة هذا الأمر ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) للحصول على دقة أفضل لكيفية تأثير الكربوهيدرات على تراكم بكتيريا البروبيوتيك5. يجمع IFC بين الأهمية الإحصائية لأحجام العينات الكبيرة ف...

يعتبر التجمع الذاتي البكتيري خطوة أساسية في تكوين الأغشية الحيوية. في هذه العملية (تسمى أحيانا التراص الذاتي أو التلبد) ، تشكل البكتيريا من نفس النوع كتلا متعددة الخلايا تستقر في النهاية في قاع أنابيب الاستزراع أو تلتصق بالأنسجة أو السطح المستهدف1.
التجميع الذاتي هو ظاهرة لوحظت على نطاق واسع وقد ثبت حتى الآن في مسببات الأمراض سالبة الجرام مثل العامل الممرض الانتهازي Acinetobacter baumannii2 ، ومسببات الأمراض السنية Aggregobacter actinomycetemcomitans3 ، والممرض الناشئ Burkholderia pseudomallei4. كما تم وصف التجميع الذاتي في العديد من سلالات البروبيوتيك إيجابية الجرام5،6،7،8. في Lactobacillus (L.) acidophilus ، تم التوسط في التجميع الذاتي جزئيا بواسطة بروتينات الطبقة S وارتبط بالالتصاق بزيلان7. وبالمثل ، وجدنا علاقة بين التجميع الذاتي المعتمد على الجلوكوز وتحريض الخصائص اللاصقة (كما تم الحكم عليها من خلال الالتصاق بالميوسين) لأنواع البروبيوتيك Lacticaseibacillus rhamnosus GG و Lacticaseibacillus casei و L. acidophilus و Lacticaseibacillus paracasei و Lactiplantibacillus plantarum5. يعكس التجميع الذاتي المتزايد على الأرجح التغيرات في التعبير عن الالتصاقات الخلوية استجابة للجلوكوز وتقويمه9. في حين أن الآليات الجزيئية للتجميع الذاتي لم يتم تحديدها بعد ، فقد ثبت أن هذه العملية تغير النمط الظاهري للبكتيريا المجمعة وتمنحها قدرة معززة على تحمل الضغوطات البيئية1 ، فضلا عن زيادة الحساسية لجزيئات استشعار النصاب10.
وقد استخدمت عدة نهج لقياس التجميع الذاتي؛ يتمثل أحد الأساليب التجريبية في السماح للثقافات بالوقوف بشكل ثابت في أنابيب الاستزراع الضيقة لفترة معينة. تظل ثقافات التحكم عكرة ، في حين أن ثقافات التجميع الذاتي ستستقر في قاع الأنبوب. يقيس نهج أكثر كمية التجميع الذاتي عن طريق الترسيب أو تسوية الفحص11.
كما تم استخدام قياس التدفق الخلوي بشكل متزايد في السنوات الأخيرة للتحقيق في التجميع الذاتي للبكتيريا. هذه الطريقة مناسبة لتحليل الجسيمات التي يتراوح حجمها بين 0.5 و 1000 ميكرومتر تقريبا. يتم تعليق البكتيريا المفردة أو الركام المشكل في سائل ، ويتم تغذيتها في تيار ، ويمكن اكتشافها واحدة تلو الأخرى11. يسمح تسجيل الضوء المتناثر الأمامي بقياس الحجم النسبي للخلية أو الركام. إنه سريع نسبيا ومباشر ولكن لا يمكنه اكتشاف العديد من المعلمات ، مثل الحجم الإجمالي أو متوسط عدد الخلايا في التجميعات. لذلك ، يمكن استكمال هذا النهج مجهريا ، مما يسمح بفحص المزيد من المعلمات12. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري التقليدي يستغرق وقتا طويلا وبالتالي يحد من عدد العينات المختبرة والقوة الإحصائية للتحليل. بشكل عام ، يوفر قياس التدفق الخلوي التصويري العديد من الميزات مقارنة بقياس التدفق الخلوي التقليدي ، مثل التحليل المتزامن لمورفولوجيا الخلية والنمط الظاهري ، وإجراء التحليل المستند إلى الصور ، واكتشاف الأحداث النادرة ، والتحقق من صحة بيانات قياس التدفقالخلوي 13. تعزز هذه المزايا قدرات قياس التدفق الخلوي وتسهل فحصا أكثر تفصيلا لمجموعات الخلايا.
توفر هذه الدراسة بروتوكولا قيما لقياس التدفق الخلوي للتصوير لمراقبة التجمع الذاتي في بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB). هذه القضبان إيجابية الجرام هي لاهوائيات اختيارية وتنتمي إلى مجموعة LAB. تولد مخمرات الجلوكوز الفعالة حمض اللاكتيك كمنتج نهائي رئيسي لاستقلاب الكربوهيدرات14. هذه البكتيريا هي أعضاء أساسيون مفيدون في الميكروبيوم وتوجد بشكل طبيعي في الجهاز الهضمي (GIT) للإنسان ، وكذلك في الجهاز البولي التناسلي للإناث15. لذلك ، فإن التوصيف الدقيق لخصائص التجميع الذاتي الخاصة بهم له أهمية عالية في مجال التكنولوجيا الحيوية والسريرية.
أشارت النتائج السابقة التي توصلنا إليها إلى أن المستوى القاعدي للتجميع الذاتي يختلف بين سلالات البروبيوتيك المختلفة. يتأثر هذا التباين بالكربوهيدرات المختلفة المستخدمة كمصدر للكربون5. للتغلب على هذه الخاصية الأساسية للبكتيريا بروبيوتيك ، تم رصد آثار الكربوهيدرات من النظام الغذائي على التجميع الذاتي على مستوى الخلية الواحدة باستخدام IFC. يجمع هذا النهج القائم على مؤسسة التمويل الدولية بين قوة وسرعة مقاييس التدفق الخلوي التقليدية مع دقة المجهر. لذلك ، فإنه يسمح بالقياسات المورفومترية المعقدة عالية المعدل بطريقة محددة ظاهريا16,17. يمكن توسيع هذا النهج ليشمل بكتيريا البروبيوتيك والمسببة للأمراض الأخرى ، جنبا إلى جنب مع مراسلي الفلورسنت لمراقبة التعبير الجيني ، والسلالات الموسومة بالفلورسنت لمراقبة وجود ووفرة أنواع بكتيرية معينة في المجاميع غير المتجانسة.

<table><tbody><tr><td>14 مل أنابيب ثقافة Falcon</td><td></td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنبوب الطرد المركزي</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>باكتو أجار</td><td>بايتون ، ديكنسون وشركاه</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>باكتو مرق الصويا النموذجي</td><td>بايتون ، ديكنسون وشركاه</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - الجلوكوز</td><td>سيجما</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - رافينوز خماسي هيدرات</td><td>سيجما</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS مرق</td><td>Baeton و Dickinson and Company</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 مل (Eppendorf)</td> <td>FL Medical</td><td>23053</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N / A</td> <td>& nbsp ؛ التفاصيل متوفرة على: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1</td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; التفاصيل متوفرة عند: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>MOPS ، 3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك</td><td>فيشر الكواشف الحيوية</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة</td><td>فيشر ساينتيك ، 174.18 جم / مول</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة</td><td>سيجما ، 136.09 جم / مول</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس التدفق الخلوي التصويري لدراسة التجميع الذاتي الميكروبي

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

تلعب البكتيريا المفيدة والبروبيوتيك أدوارا أساسية في مضيفيها ، حيث توفر فوائد صحية مختلفة ، بما في ذلك المناعة ضد الأمراض المعدية. تتكون عائلة Lactobacillaceae من بكتيريا إيجابية الجرام ذات خصائص بروبيوتيك مؤكدة. تستخدم هذه الدراسة أنواع Lactobacillaceae كنموذج لإثبات فعالية تحليل الإنتاجية العالية أحادية الخلية في دراسة التجميع الخلوي. ينصب التركيز على تحليل استجابة هذه الأنواع المفيدة للكربوهيدرات البسيطة من النظام الغذائي.
تعرض الدراسة كيف يمكن لقياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) التغلب على الاختلافات الأساسية في تجميع بكتيريا البروبيوتيك في وجود وغياب الكربوهيدرات. يجمع IFC بين قوة وسرعة قياس التدفق الخلوي التقليدي والدقة المكانية للفحص المجهري ، مما يتيح قياسات مورفومترية معقدة عالية المعدل بطريقة محددة ظاهريا عبر مكتبة من السلالات والظروف البكتيرية المفيدة. يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة حول التجميع الذاتي لأنواع Lactobacillaceae ويلقي الضوء على استجابتها للكربوهيدرات الغذائية ، مما يساهم في فهم الآليات الكامنة وراء الآثار المفيدة لهذه البكتيريا بروبيوتيك.

توضح النتائج أن هذه الطريقة يمكن بسهولة قياس الاختلافات في التجميع الذاتي استجابة للسكريات الغذائية في بكتيريا LAB. من خلال فصل الأفراد عن المجاميع ، تسمح الطريقة بحساب النسبة المئوية لسكان أحداث التجميع من جميع الأحداث استجابة للسكريات القابلة للتخمير أو غير القابلة للتخمير من النظام الغذائي. بالإضافة إلى ذلك ، كان من الممكن قياس ما إذا كانت هناك اختلافات في متوسط حجم إجمالي السكان بين العلاجات.
توضح الصور التمثيلية في الشكل 3 استراتيجية البوابات لكل بكتيريا LAB....

يصف هذا البروتوكول نهجا كميا لقياس التجميع الذاتي الميكروبي باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

استخدمت هذه الدراسة أنواع Lactobacillus كنموذج لإثبات فعالية تحليل قياس التدفق الخلوي التصويري في دراسة التجميع الذاتي الميكروبي. ينصب التركيز على تحليل استجابة التجميع الذاتي لأنواع Lactobacillus للكربوهيدرات البسيطة من النظام الغذائي. الطرق الأكثر استخداما لقياس التجميع الذاتي هي القياس الضوئي الطيفي ، الذي يقيس المعلقات الميكروبية أو التعكر أو الكثافة الضوئية ، وتقنيات الفحص المجهري التقليدية ، مثل المجال الساطع وتباين الطور والمجهر الفلوري.عند الحديث عن التصوير عالي الإنتاجية ، فإن أحد التحديات التجريبية الرئيسية هو تجزئة حدث واحد. في هذا البروتوكول ، هو تجميع واحد. يعالج قياس التدفق الخلوي التصويري هذا التحدي بأناقة ويمنح الباحثين أداة قوية لدراسة التجميع الذاتي.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذه المقالة، نحن وصف طريقة استخدام متعددة الأطياف التدفق الخلوي التصوير لقياس استيعاب النانوية polyanhydride أو البكتيريا بواسطة الخلايا 264.7 الخام.

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

نقدم أساليب لدراسة تأثير PSMS وغيرها من السموم التي...

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

توضح هذه الطريقة تقنية لتقييم وظيفة الخلايا المحببة عن طريق قياس البلعمة للبكتيريا والانفجار التأكسدي في نفس الوقت. سمح قياس التدفق الخلوي المستند إلى الصورة بتحديد ثلاث مجموعات فرعية متميزة من الخلايا المحببة المنشطة والتي اختلفت جميعها في قدرتها الوظيفية النسبية.

الصورة القائمة على التدفق الخلوي وتقنيات لتقييم التغيرات في الحبيبية وظيفة في المختبر

التدفق الخلوي في تركيبة مع المجموعات المرئية يوفر وسيلة سهلة الاستخدام وسريعة لدراسة الأغشية الحيوية المائية. يمكن استخدامه لتوصيف بيوفيلم، الكشف عن التغيرات في هيكل المجتمع بيوفيلم، والكشف عن الجسيمات اللاأحيائية جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم.

توصيف الأغشية الحيوية المائية مع التدفق الخلوي

وقد ثبت تحليل تدفق سيتوميتريك قيماً للتحقيق في ثقافات نقية ورصد ديناميات المجتمع الميكروبية. نحن نقدم ثلاث مهام سير العمل شاملة، من أخذ عينات لتحليل البيانات، نقية الثقافات والمجتمعات المعقدة في متوسطة واضحة كذلك كما هو الحال في المصفوفات صعبة، على التوالي.

تميز ميكروبيومي ديناميات – التدفق الخلوي على أساس مهام سير العمل من ثقافات نقية للمجتمعات الطبيعية

تعد منحنيات الاختراق (BTCs) أدوات فعالة لدراسة نقل البكتيريا في وسائل الإعلام المسامية. هنا نقدم الأدوات القائمة على الأجهزة المائعة في تركيبة مع المجهر والفرز تدفق cytometric للحصول على BTCs.

الجمع بين الأجهزة Fluidic مع المجهر والتدفق cytometry لدراسة النقل الميكروبي في وسائل الإعلام المسامية عبر المقاييس المكانية

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كمية ملزمة من الممرض eukaryotic فيروس النورو البشري للبكتيريا. بعد إجراء قياس أولي لارتباط بكتيريا الفيروسات ، يتم استخدام قياس الخلايا للتدفق للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالفيروسات داخل السكان.

تحديد كمية بشرية فيروس نوروفيروس مثل الجسيمات ملزمة لبكتيريا كومينسال باستخدام تدفق قياس الخلايا

يمكن أن يساهم عزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتوصيفها عن طريق قياس التدفق الخلوي بشكل كبير في فهم نمط الاستجابة المناعية ضد الغرسات. يصف هذا البحث طريقة دقيقة لعزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتلطيخها لتحليل التدفق الخلوي.

قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لتحليل الوظيفة المناعية لأنسجة الزرع المشرحة

الاصطناعية التليف الكيسي البلغم المتوسطة (SCFM2) يمكن استخدامها في تركيبة مع كل من الليزر confocal المسح المجهري والفلورسينس تنشيط فرز الخلايا لمراقبة المجاميع البكتيرية في قرار عالية. تفصل هذه الورقة طرق تقييم المجموعات السكانية الإجمالية أثناء العلاج المضاد للميكروبات كمنصة للدراسات المستقبلية.

أدوات للتقييم في الوقت الحقيقي لنموذج عدوى السودوموناس aeruginosa

اكتشف تحليل التدفق الخلوي التصويري لدراسة التجميع الذاتي الميكروبي في بكتيريا Lactobacillaceae. يوضح هذا البروتوكول كيفية قياس استجابة التجمعات للكربوهيدرات الغذائية بدقة عالية.

قياس التدفق الخلوي التصويري لدراسة التجميع الذاتي الميكروبي

استكشف المزيد من الفيديوهات