نموذج ماوس في فيفو إلى تدبير السذاجة CD4 تي خلية التنشيط وانتشارها والتمايز Th1 الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة حول تنشيط الخلايا التائية والتكاثر وتمايز Th1 ، بالإضافة إلى تحفيز الخلية التي تقدم المستضد للمناعة التكيفية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة بيئة في الجسم الحي مع السماح في نفس الوقت بالتلاعب بالخلايا في المختبر. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب إتقان عزل الأعضاء والعظام وخطوات النقل بالتبني من خلال التعليمات النصية وحدها.

لعزل خلايا نخاع العظم ، قم بتطهير الأطراف الخلفية للفأر البالغ بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدم المقص لعمل شق جانبي في الجلد عبر الأطراف الخلفية. أدخل مقصا في الجانب الإنسي من الساقين ، وقطع الجلد بالمقص حتى بداية الأطراف الخلفية. ثم استخدم الملقط لفصل الجلد عن الساقين.

باستخدام المقص ، افصل العضلة عن عظم الفخذ والساق ، واستخدم المقص لتفكيك مفصل الورك ، وكسر رأس عظم الفخذ. ثم افصل الإناث عن الساق دون كسر نهايات العظام ، وضع العظام في طبق بتري متوسط كامل على الجليد. عندما يتم حصاد جميع العظام ، قم بقطع الأطراف القريبة والبعيدة من كل عظم بعناية بمشرط ، واستخدم حقنة 1 مليليتر مزودة بإبرة 25 مليتر لغسل العظام بشكل متكرر بحجم إجمالي يبلغ 10 ملليتر من وسط RPMI الكامل الدافئ.

عندما يتم مسح جميع العظام ، انقل محتويات الطبق بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مزود بفلتر ويب من النايلون المسام بطول 70 ميكرومتر ، وقم بإزالة أي حطام وتكتلات خلوية بعناية مع التحريك اللطيف والماصة. اجمع خلايا نخاع العظم عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في مليليتر واحد من أربع درجات مئوية لتحلل خلايا الدم الحمراء مع سحب العينات، واحتضان المزيج على الثلج لمدة خمس دقائق.

في نهاية الحضانة ، أوقف التحلل ب 10 ملليلتر من PVS ، وأعد تعليق الحبيبات في 25 ملليلتر من الوسط الكامل لجهاز طرد مركزي ثان. ثم أعد تعليق الخلايا في 5 مليليترات من وسط كامل طازج للعد ، وقم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى. لعزل خلايا الأنسجة اللمفاوية الثانوية ، اجمع الغدد الليمفاوية الأربية والإبطية والعضدية وعنق الرحم والمساريق والطحال من الفئران المعدلة وراثيا OT-II ، وانقل الأنسجة اللمفاوية الثانوية إلى طبق بتري بلاستيكي يحتوي على 10 ملليتر من وسط RPMI الكامل.

عندما يتم حصاد جميع الأنسجة ، انقل الغدد الليمفاوية والطحال إلى مصفاة خلوية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مليلتر ، واستخدم مكبس حقنة لتجانس الأنسجة. اغسل المصفاة بما يصل إلى 15 مللي من الوسط ، وقم بتدوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم قم بعزل الخلايا التائية الإيجابية CD4 عن طريق فرز الخرزة المغناطيسية ، وفقا للبروتوكولات القياسية.

من أجل التنشيط في الجسم الحي للخلايا التائية الساذجة OT-II CD4 ، قم بتسمية الخلايا التائية المعزولة بالخرزة المغناطيسية بصبغة تتبع الخلايا الحيوية ، وفقا للبروتوكولات القياسية ، وأعد تعليق الخلايا المصنفة عند 10 إلى الخلايا السادسة لكل 100 ميكرولتر من تركيز PBS. ثم انقل 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بالتبني عبر وريد الذيل. قم بتسخين الفئران مسبقا قبل الحقن للتأكد من أن أوردة الذيل متوسعة بدرجة كافية للسماح بتوصيل حجم الخلية بالكامل.

بعد 24 ساعة ، قم بتسليم 10 إلى الخلايا المتغصنة الخامسة المحملة بالببتيد OVA الناضجة LPS عن طريق الحقن تحت الجلد في وسادة القدم لكل يتم حقنه بالخلايا التائية. بعد يومين وخمسة أيام من تحدي التبني ، قم بحصاد الغدد الليمفاوية المأبضية من المتلقية لمعالجة الأنسجة وعزل الخلايا التائية ، كما هو موضح. لتحليل تنشيط الخلايا التائية ، قم بتلطيخ الخلايا المعزولة في اليوم مع الأجسام المضادة الفلورية ضد CD4 و CD69 و CD25 لتحديد النسبة المئوية للخلايا التائية الإيجابية ل CD64 والإيجابية CD25 داخل السكان المتلقين الإيجابي CD4 عن طريق قياس التدفق الخلوي.

لتقييم تكاثر الخلايا التائية ، قم بتلطيخ الخلايا المعزولة في اليوم الخامس مع الأجسام المضادة الفلورية المناسبة ضد CD4 ، وتحليل تحلل إشارة صبغة تتبع الخلايا الحيوية في مجموعة الخلايا التائية الإيجابية CD4 المانحة عن طريق قياس التدفق الخلوي. لتقييم تمايز Th1 ، لوحة أربعة أضعاف 10 إلى اليوم الخامس خمس خلايا تائية معزولة لكل بئر في 200 ميكرولتر من الوسط الكامل ، مع استكمال الأيونومايسين و PMA لكل بئر ، في صفيحة 96 بئر. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات ، مع إضافة Brefeldin A إلى كل بئر لمنع إفراز السيتوكين خلال الساعات الأربع الأخيرة من التحفيز.

في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق الانعكاس السريع. تلطيخ الخلايا بجسم مضاد مضاد ل CD4 ، متبوعا بالتثبيت في 100 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد و 1٪ سكروز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بنفاذية الخلايا ب 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للنفاذية لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، متبوعا بغسل بالطرد المركزي مع 150 ميكرولتر من PBS لكل بئر.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ السيتوكينات داخل الخلايا ذات الأهمية ، وفقا للبروتوكولات القياسية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بغسلتين بالطرد المركزي مع 150 ميكرولتر من PBS مكملة بنسبة 1٪ سابونين لكل بئر. ثم قم بتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. يكشف تحليل التدفق الخلوي للخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام GM-CSF بعد تحفيز LPS ، عن تنظيم علامات النضج ، مثل MHCII و CD80 و CD86.

يتم تنشيط الخلايا التائية الإيجابية CD4 الساذجة OT-II بعد النقل بالتبني إلى المتلقية عن طريق تنظيمها لعلامات تنشيط الخلايا التائية ، والتعبير السطحي ، وجولات متعددة من انقسام الخلايا. عند التنشيط ، تظهر الخلايا التائية OT-II الإيجابية للقرص المضغوط نمطا ظاهريا Th1 ، كما يتضح من تعبير جاما الإنترفيرون داخل الخلايا. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير جميع الكواشف والمواد في اليوم السابق للتجربة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في علم المناعة لدراسة الخلايا المتغصنة والخلايا التائية في الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل نخاع العظم عن عظم الفخذ والساق للفئران ، وكيفية نقل الخلايا التائية والخلايا المتغصنة إلى المتلقية.

لا تنس أن العمل باستخدام الأدوات الحادة مثل الإبر أو المشارط أو المقص ، يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذلك يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام حماية الإصبع المناسبة أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.