التنمية وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية مورين توليروجينيك

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تطوير وتوصيف الخلايا المتغصنة ذات التحمل في الفئران لتقييم فائدتها العلاجية المناعية في علاج اضطرابات المناعة الذاتية ، مثل التصلب المتعدد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاج بالخلايا المتغصنة ذات التحمل من خلال توفير طريقة موحدة لتطوير وتوصيف الخلايا المتغصنة ذات التحمل وظيفيا. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن استخدامها لتطوير الخلايا المتغصنة التحمل بنجاح ولاختبار فعالية الخلايا المتغصنة الوظيفية.

الآثار المترتبة على هذه التقنية كبيرة. وهي تمتد نحو تطوير العلاج المناعي الخلوي لاضطرابات المناعة الذاتية ، حيث يمكن للخلايا المتغصنة ذات التحمل إعادة ضبط الاستجابة المناعية غير الطبيعية بينما تظل خاضعة لآليات التنظيم المناعي الجوهرية. بعد حصاد عظام الساق الخلفية من الفئران C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين ثمانية و 10 أسابيع ، وفقا للبروتوكولات القياسية ، استخدم الشفرات والملقط الجراحي لتشريح أكبر قدر ممكن من الأنسجة ووضع الظنبوب وعظم الفخذ النظيف في طبق استزراع يبلغ طوله ستة سنتيمترات يحتوي على 70٪ من الإيثانول.

قم بقص طرفي العظام بشفرة جراحية واستخدم حقنة سعة ثلاثة ملليلتر ، مزودة بإبرة قياس 23 ، لطرد النخاع من العظم الأول بثلاثة ملليلتر من PBS في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. عندما يتم جمع كل النخاع ، قم بعمل الطرد المركزي لتعليق الخلية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء. بعد خمس دقائق ، أوقف التحلل بتسعة ملليلتر من PBS واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق حبيبات خلية نخاع العظم الأبيض في 10 ملليلتر من وسط الثقافة وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب جديد. اضبط الخلايا على تركيز واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في وسط الثقافة المكملة ب GM-CSF و IL-4. وقم بوضع ثلاثة ملليلتر من الخلايا في كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم الثالث ، اغسل الخلايا في كل بئر بملليلترين من PBS ودوامة لطيفة لإزالة الخلايا غير الملتصقة. ثم قم بتغذية الخلايا بثلاثة ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج المكمل ب GM-CSF و IL-4 وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا ، مع إضافة ثلاثة ملليلتر أخرى من وسط الاستزراع الطازج ، مع استكمال السيتوكينات لكل بئر بعد يومين. في اليوم السابع من الثقافة ، ضع الطبق على الجليد.

بعد 10 دقائق ، قم بتقطيع وسط المزرعة برفق في كل بئر لإخراج الخلايا المتغصنة غير الناضجة والمشتقة من نخاع العظام غير الملتصقة بشكل فضفاض إلى معلق. بعد ذلك ، قم بتجميع الخلايا للتجميع عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من وسط الاستزراع الطازج لتحليل المصب اللاحق. لقياس تكاثر الخلايا التائية المتزابكة ، استخدم أولا الطرف الخلفي لمكبس حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لهرس الطحال من فأر OT2 C57BL / 6 يبلغ من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وشطف المصفاة باستخدام PBS.

قم بتكبيل تعليق الخلية المجمعة عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية و 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للخلايا التائية الإيجابية CD4 عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الفرز و 200 ميكرولتر من حبات البيوتين المضادة للخلايا لمدة 10 دقائق وأربع درجات مئوية ووضع عمود حبة مغناطيسي ومرشح فصل مسبق في مغناطيس فصل خلية بحجم مناسب. اشطف العمود بثلاثة ملليلتر من مخزن الفرز وأضف تسعة ملليلتر من مخزن الفرز إلى الخلايا.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلية وحبيبات الخرزة في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للفرز وأضف تعليق الخلية إلى العمود لجمع شطف الخلايا التائية الموجبة CD4 في حاوية مناسبة. ثم اغسل العمود بثلاثة ملليلتر أخرى من المخزن المؤقت للفرز ، وجمع التدفق من خلال وضع الخلايا التائية على الجليد. لعزل الخلايا المتغصنة لعموم الطحال الزاوي ، ضع الطحال من فأر C57BL / 6 يبلغ من العمر ثمانية إلى عشرة أسابيع في طبق استزراع يبلغ طوله ستة سنتيمترات واستخدم حقنة سعة ملليلتر واحد ، مزودة بإبرة قياس 25 ، لحقن مليلتر واحد من محلول الكولاجيناز D في الطحال مرتين.

بعد ذلك ، استخدم المقص لتقطيع الطحال إلى قطع صغيرة واحتضان القطع مع الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. في نهاية الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA إلى ملاط الأنسجة للحصول على حضانة أخيرة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، استخدم الطرف الخلفي لمكبس حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لهرس ملاط الطحال من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية ، و 50 ميكرولتر من كاشف حجب مستقبلات Fc ، و 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للبيوتين للخلايا المتغصنة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في تسعة ملليلتر من عازلة الفرز وأعد تعليق الحبيبات في 800 ميكرولتر من مخزن الفرز الطازج مع 200 ميكرولتر من الخرز المضاد للبيوتين عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لعزل مجموعة الخلايا المتغصنة الطحالية عن طريق فرز الخرزة المغناطيسية ، كما هو موضح للتو. أعد تعليق الخلايا عند مرتين في 10 إلى الخلايا المتغصنة الخامسة لكل تركيز مليلتر ومعالجتها بالتركيز التجريبي المناسب للثلاثي التربينويد محل الاهتمام لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

خلال الثلث الأخير من الحضانة ، أعد تعليق الخلايا التائية عند تركيز واحد في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر في CFSE ميكرومولار واحد لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS وأعد ضبط الحجم إلى تركيز نهائي مرتين في 10 إلى الخلايا التائية السادسة لكل مليلتر. الزراعة المشتركة 100 ميكرولتر من الخلايا التغصنية المعالجة مع 100 ميكرولتر من الخلايا التائية الإيجابية CD4 المسماة CFSE في كل بئر من صفيحة 96 بئرا وإضافة 100 نانوغرام لكل مليلتر من ببتيد OVA 323-329 إلى الخلايا ، وقياس شدة CFSE للخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحضانة.

تظهر الخلايا السلفية لنخاع العظم المزروعة في وسط كامل ، في وجود GM-CSF و IL-4 ، مورفولوجيا الخلايا المتغصنة غير الناضجة بعد ستة أيام في المزرعة. يكشف تحليل الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام غير الناضجة عن التعبير القوي عن CD11c ، وهي علامة محددة للخلايا المتغصنة في الفئران ، من قبل غالبية الخلايا المستنبتة. على الرغم من عدم وجود تأثير على التعبير عن علامات النضج التي يسببها LPS ، إلا أن الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام تظهر ملف تعريف خلية تغصنية تحمل المنشأ استجابة لعلاج CDDO-DFPA كما يتضح من انخفاض كبير في التعبير الجيني المؤيد للالتهابات والتعبير الجيني المعزز للسيتوكين المضاد للالتهابات ، حتى بعد تحفيز LPS.

بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ انخفاض كبير في تكاثر الخلايا التائية التركيبية الخاصة ب OVA في الثقافات المشتركة في المختبر حيث يتم تقديم OVA بواسطة الخلايا المتغصنة المعالجة CDDO-DFPA وفي الجسم الحي كما يتضح من التقدم المتأخر إلى التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي بعد حقن الخلايا المتغصنة المعالجة CDDO-DFPA النبضية MOG ، مما يؤكد النمط الظاهري للتحمل لهذه الخلايا. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن تطوير الخلايا المتغصنة ذات التحمل في غضون ثمانية أيام ، إذا تم إجراء التجارب بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الخلايا المتغصنة ذات التحمل ليست متجانسة.

يعتمد نمطها الظاهري الخلوي على طبيعة العوامل المستخدمة في تحريض تحملها. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التحليل التفصيلي للتدفق الخلوي ، للإجابة على أسئلة إضافية حول طاقة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد التي تسببها الخلايا المتغصنة أو موت الخلايا المبرمج أو القدرة على تمايز الخلايا التائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير الخلايا المتغصنة النشطة وظيفيا باستخدام عوامل معروفة أو كيفية اختبار قدرة المواد الجديدة على تحفيز هذه الخلايا.