جيل من نخاع عظام الفئران الخلايا الجذعية المشتقة للاستخدام في 2 الفوتون التصوير

يوفر تحضير الخلايا المتغصنة من نخاع العظم مصدرا ممتازا للخلايا العارضة للمستضد التي يمكن استخدامها في التجارب المختبرية أو في الجسم الحي في تصويرين لجهاز المناعة. يسمح إدخال الخلايا العارضة للمستضد بدراسة تفاعلات خلايا الخلية الخاصة بالمستضد في سياق العقدة الليمفاوية الحية. نوضح هنا العزلة المعقمة لنخاع العظام وتقنيات الاستزراع لإنتاج الخلايا المتغصنة الناضجة.

علاوة على ذلك ، نتابع تطور الخلايا المتغصنة من اليوم الأول إلى اليوم 11. تم تصوير هذا التطور بصور ثابتة وفي مقاطع فيديو حاضنة تم إنشاؤها باستخدام موقع تقنيات الرائحة. أخيرا ، نعرض الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم التي تقدم مستضد كوف إلى خليتين تائية OT في العقدة الليمفاوية العاكسة.

مرحبا ، أنا ميلاني ماثيو في مختبر ميكا هالين في جامعة كاليفورنيا القريبة. هل تساءلت يوما عما يحدث في الداخل أثناء المسبار أثناء نمو خلاياك؟ اليوم؟

كجزء من بروتوكولنا ، سنوضح لك كيفية استخدام بعض الأدوات S في الموقع. يسمح لك الموقع المحبر بتتبع نمو زراعة الخلايا في الحاضنة الخاصة بك. في هذا البروتوكول ، سنوضح لك كيفية عزل وتحضير نخاع العظم المشتق وتجميع الخلايا من الفأر.

لذا فإن أول شيء سأريكم كيفية القيام به هو إزالة عظام عظم الفخذ وعزل نخاع العظم أولا تثبيت. بعد ذلك ، بلل بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شقك الأول على طول خط الوسط للحيوان.

ثم اقطع داخل الساق كما أريكم هنا. لفضح الأنسجة العضلية فوق عظم الفخذ ، يجب أن تكون قادرا على سحب العضلات جانبا وإمساك عظم الفخذ الكبير باستخدام ملاقط التشريح. أثناء إمساك العظم بملاقط التشريح ، تحرك لأسفل العظم وقم بإجراء القطع الأول أسفل المفصل مباشرة.

ثم اعمل على طول عظم الفخذ واجعله مقطوعا بالقرب من الجسم قدر الإمكان. قد يؤدي ذلك إلى القليل من الدم ، خاصة إذا قمت بقطع الشريان الفخذي. عند إزالة عظم الفخذ ، من المهم للغاية أن يظل العظم سليما.

كما ترون هنا في نهايات العظام لم يتم قطعها أو تعطيلها. بمجرد إزالة عظم الفخذ ، قم بقص أي منديل إضافي وضع عظم الفخذ في طبق صغير من وسائط PMI الخاصة بنا. عند إزالة الأنسجة الإضافية ، تأكد من أن عظم الفخذ لا يجف.

في هذه المرحلة ، يجب نقل عظام عظم الفخذ إلى طبق يحتوي على 70٪ من الإيثانول ووضعها على الجليد لمدة خمس إلى 10 دقائق. لغرض هذا الفيديو ، سنستمر في مقعد المختبر. ومع ذلك ، في هذه المرحلة من التجربة ، يجب نقل كل شيء إلى غطاء لزراعة الأنسجة.

العظام في الإيثانول ، يمكنك نقلها إلى طبق أطباق أكبر من الوسائط المعقمة لإزالة نخاع العظام. الآن نحن على استعداد لإزالة وتعليق نخاع العظام. املأ حقنة الأنسولين بوسائط معقمة وضعها على الجانب لاستخدامها لاحقا.

أمسك العظم بالملاقط المعقمة. امسكها فوق طبق صغير للقطع المهملة واقطع المشاشية أو نهايات العظم من كل جانب. ضع حقنة الأنسولين في جانب واحد من العظم واغسل النخاع من العظم إلى 15 مل من الوسائط.

اغسل العظم مرة أو مرتين أخريين حتى يتم التخلص من النخاع بالكامل. بمجرد إخراج النخاع من العظم ، سيكون أبيضا بالكامل تقريبا. ضع العظم النظيف في طبق التخلص منه وكرر عملية عظم الفخذ الآخر.

بمجرد اكتمال ذلك ، قم بتعطيل أي قطع نخاع لم يتم تفكيكها بواسطة عملية الغسيل برفق لإنشاء تعليق خلية واحدة. سيستغرق ذلك من خمس إلى 10 دقائق من سحب العينات. ضع معلق خلية واحدة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، واغسل اللوحة ثلاث مرات على الأقل باستخدام 10 مل من الوسائط.

في كل مرة ، قم بتدوير الخلايا وإزالة الوسائط وإعادة تعليق الخلايا عن طريق تنظيف أصابعك بقوة وسرعة على قاع الأنبوب. لإزالة خلايا الدم الحمراء أو كرات الدم الحمراء ، نقوم بإجراء تحلل الماء. طريقة أخرى لإزالة خلايا الدم الحمراء هي تحلل كلوريد الأمونيوم.

تم وصف كلتا الطريقتين في مقالات فيديو JoVE السابقة. عزل القرص المضغوط أربع خلايا تائية إيجابية من الغدد الليمفاوية للفأر باستخدام تنقية ميلان ماكس JoVE العدد التاسع وإعداد عامل نمو الخلايا التائية من خلايا الفئران JoVE. القضية 10.

بعد إزالة كرات الدم الحمراء الخاصة بك ، أنت الآن جاهز لثقافة أنفسكم. لذا قبل أن آخذك عبر زراعة خلايا التغصنات ، أود أن أقدم لكم موقع إنكوس. سيسمح موقع Incus بطرح نمو زراعة الخلايا بالتنبؤ داخل الحاضنة حتى نتمكن من مشاهدة أنفسنا حول كيفية تصرفهم أو إساءة التصرف.

بمجرد إعداد المزرعة، يمكنك وضعها في درج الحجم المناسب وإغلاق موقع الوصرة. ثم على جهاز الكمبيوتر الخاص بك ، يمكنك ببساطة تعيين الفاصل الزمني ثم اختيار الآبار التي ترغب في تصويرها والسماح للموقع المحبر بجمع البيانات نيابة عنك. ستظهر لك الأفلام في هذا البروتوكول ، وتوضح تغييرات مورفولوجيا الخلايا المتغصنة في المختبر.

تم تصدير مقاطع الفيديو هذه مباشرة من برنامج موقع Incus. نظرا لأن الخلايا المتغصنة تتطور من اليوم الأول إلى اليوم الحادي عشر ، يمكنك أن ترى تغيرا حقيقيا في التشكل أثناء تضخمها وأخذها النمط الظاهري للخلية المتغصنة. بعد التحلل وكرات الدم الحمراء وإزالتها ، يتم غسل الخلايا في وسائط الخلايا التغصنية الأولية وطلاءها بمعدل 5 ملايين لكل مل.

يجب استزراع هذه الخلايا في البداية في وسط زراعة الخلايا المتغصنة الأولية ، وبعد ذلك نقوم بزراعتها في وسائط DC الثانوية ، والتي تستكمل ب 40 نانوغرام لكل مل IL أربعة ومائة نانوجرام لكل مل TNF alpha. ستساعد هذه السيتوكينات في تطوير الخلايا المتغصنة الناضجة التي تشبه الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية. لذا سأريكم الآن كيف تبدو الثقافات أثناء تطورها وكيفية الحفاظ عليها بمرور الوقت.

بمجرد طلاء الخلايا ، يمكنك زراعة الخلايا المتغصنة لمدة 72 ساعة قبل تغيير الوسائط لأول مرة. إليك الشكل الذي ستبدو عليه ثقافتك النموذجية بعد أن تقوم بتقطيع الخلايا في اليوم الأول. وإليك نظرة على الخلايا.

في اليوم الثالث ، يمكنك أن ترى أن الخلايا بدأت في الالتصاق بالصفيحة ولكنها لم تأخذ النمط الظاهري للخلية المتغصنة الكلاسيكية. في اليوم الرابع ، قم بإزالة الوسائط وأضف 10 ملايين من طموح وسائط DC الأولية الجديدة لوسائل الإعلام. في اليوم الرابع ، سنقوم بإزالة الخلايا الليمفاوية في أي خلايا أخرى غير ملتصقة.

يمكنك الآن إعادة أنفسكم إلى الحاضنة لمدة ثلاثة أيام أخرى ، بعد سبعة أيام من الطلاء الأولي. إليك الشكل الذي ستبدو عليه ثقافتك النموذجية. يمكنك معرفة أن الوقت قد حان لتقسيم الخلايا وتكرارها.

في اليوم السابع ، تتم إزالة الخلايا المتغصنة من اللوحة عن طريق شفط الوسائط ثم إضافة 300 مللي مولار معقم EDTA واحتضانه لمدة خمس دقائق. ثم يتم شطف اللوحة بشكل متكرر عن طريق الإمساك بزاوية 45 درجة وسحب محلول EDTA على الجزء الخلفي من اللوحة. يتم ذلك لعدة دقائق لضمان إزالة جميع الخلايا المتغصنة الملتصقة.

يتم جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 ملم وغسلها مرتين بوسائط DC ثانوية. ثم يتم تعليق الخلايا وطلاءها عند 5 ملايين خلية لكل لوحة. تستقر الخلايا المتغصنة السابع المعاد طلاؤها حديثا في قاع اللوحة بسرعة في قاع اللوحة ، وتلتصق وتبدأ في الانتشار.

كما ترون هنا في فيديو موقع Zichy ، تم التقاط هذا الفيديو في الحاضنة على مدار يومين ليظهر لك تطور الخلايا المتغصنة من إعادة الطلاء الأولية التي تم إجراؤها في اليوم السابع إلى أوائل اليوم التاسع. يمكن تنشيط الخلايا المتغصنة المورفولوجية في نبضة المستضد عن طريق إضافة ميكروغرامين لكل LLPS هنا مع مائة ميكروغرام للبويضات للاستخدام مع الخلايا التائية المنقاة من فئران OT ، والتي تحتوي على أربع خلايا تائية موجبة للبويضات. إذا كنت تستخدم مستضد مختلفا ، فمن المهم التأكد من استخدام التركيز الأمثل للمستضد لنبض dcs هنا ، تتم إضافة OV و LPS إلى الوسائط الأولية بحيث يكون التركيز النهائي ل LPS ميكروغرامين لكل مل في 20 مل ، وستكون البويضات مائة ميكروغرام لكل مل في 20 مل.

إليكم صورة لما تبدو عليه ثقافة اليوم 10 النموذجية للخلايا المتغصنة. يمكنك أن ترى في هذه الصورة أن التشكل نموذجي جدا لخلية تقديم المستضد. يجب عليك دائما التحقق من النسبة المئوية للخلايا المتغصنة الموجبة CD 11 C عن طريق الفاكس.

هذا للتأكد من أن لديك ثقافة نقية نسبيا من الخلايا المتغصنة لاستخدامها في تجاربك. هنا نستخدم الموقع المحبر من أدوات SEN لمراقبة تنشيط الخلايا المتغصنة التي تم علاجها LPS في مستضد نبض في اليوم 10. يمتد هذا الفيديو على مدار 24 ساعة مباشرة بعد إضافة LPS و val و الببتيد ، وفيه تصبح الخلايا المتغصنة أكثر نشاطا وهناك بعض التغييرات المورفولوجية الواضحة.

بمجرد تنشيط الخلايا المتغصنة في نبضة المستضد ، يمكنك جمعها مرة أخرى عن طريق الحضانة باستخدام 300 ملليمولار EDTA وغسل اللوحة. الآن قم بتدوير خلاياك لأسفل ، واغسلها مرتين باستخدام 50 مل من وسائط RPMI لإزالة أي مستضد إضافي وتسميته بصبغة تعقب الخلايا المناسبة. في هذه التجربة ، سأقوم بتصوير الخلايا الموجودة في العقدة الليمفاوية الأربية.

سنحتاج إلى حقن اثنين إلى 5 ملايين خلية شجيرية في الجلد في منطقة الخاصرة للفأر الموضحة هنا. ثم نسمح ب 24 ساعة للخلايا المتغصنة إلى موطن العقدة الليمفاوية التدريبية. هنا في هذا الفيديو ، تم تصنيف الخلايا المتغصنة ب CMF two hc ، وهي صبغة تعقب الخلايا الزرقاء.

يمكنك رؤية الخلايا المتغصنة تتفاعل مع الخلايا التائية المسماة التي هي مستضد خاص بفولين. يتم تصنيف هذه الخلايا التائية ب ccf SE. يمكنك أيضا استخدام C-M-T-M-R أو أي من أصباغ تعقب الخلايا الأخرى للمجسات الجزيئية. هذه هي مرحلة التنشيط المبكرة للخلايا التائية التي تتفاعل مع DCS.

نظرا لأنها خاصة بالمستضد ، يمكنك أن ترى أن الخلايا التائية تلتصق بمحلاق DCS ذات العلامات الزرقاء. يختتم هذا بروتوكولنا الذي يوضح تحضير واستخدام الخلايا المتغصنة لنخاع العظم المشتقة من الفأر في تجربة تصوير اثنين من البوتون. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك الخاصة.