تقييم التعبير عن الهستو التوافق الكبرى مجمع الفئة الأولى على الخلايا العصبية الأولية مورين فرس النهر عن طريق قياس التدفق الخلوي

يستخدم هذا البروتوكول قياس التدفق الخلوي لتقييم تعبير معقد التوافق النسيجي الكبير خارج الخلية من الفئة 1 كميا على الخلايا العصبية الأولية المستزرعة من الفئران. يمكن أيضا إجراء التلوين المناعي NC2 لتعبير MHC1 لتجنب فقدان الإشارة بسبب البروتين أو التغيرات الثلاثية أو الهيكلية أو النفاذية أو ظروف تغيير الطبيعة. بالإضافة إلى توجيه الاستجابات المناعية للعدوى ، فإن معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة 1 يعدل الوصلات المشبكية العصبية.

ومع ذلك ، فإن العوامل التي تنظم تعبير معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة 1 لا تزال غير معروفة. تتطلب خطوات تشريح الدماغ الجنيني ممارسة لإتقانها. عند تعلم التقنية ، احرص على ممارسة التشريح دون القلق بشأن الوقت أو عملية الزراعة اللاحقة.

لعزل الحصين الجنيني ، ضع أول دماغ جنيني للفأر محصود تحت مجهر تشريح مجسم. واستخدم زوجين من ملقط دومون المعقم رقم 5 لقرص المصابيح الشمية وإزالة السحايا تماما. بمجرد إزالة السحايا تماما ، سيفتح الجانب العلوي من القشرة بشكل جانبي لفضح الحصين.

استخدم الملقط لقرص الحصين بعيدا عن القشرة المرفقة ونقل الحصين المعزول بعناية إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط السبات E على الجليد. عندما يتم جمع كل الحصين في أنبوب واحد سعة 15 مليلتر ، قم بترسيب أنسجة المخ عن طريق الطرد المركزي. استبدل المادة الطافية ب 0.5 مل من تفكك غراء طازج لكل جنين واخلط الأنبوب عدة مرات عن طريق الانعكاس.

ضع الأنسجة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع خلط العينات عن طريق الانعكاس كل 10 دقائق قبل جمع الأنسجة مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. استبدل المادة الطافية بكمية متساوية من Hibernate-E Medium الطازجة واستخدم ماصة باستور زجاجية مفتوحة بالكامل ومصقولة بالنار لترثيب الأنسجة 10 مرات. بعد ترك الأنسجة تستقر لمدة دقيقتين ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلترا.

أضف حجما متساويا من Hibernate-E Medium مرة أخرى إلى الأنسجة واستخدم ماصة باستور نصف زجاجية مفتوحة مصقولة بالنار لترتريتري الأنسجة 10 مرات. بعد ترك الأنسجة تستقر لمدة دقيقتين أخريين ، قم بتجميع المادة الطافية في أنبوب سعة 50 ملليلترا. أضف حجما متساويا من Hibernate-E Medium إلى الأنسجة وقم بتقطيع الأنسجة 10 مرات باستخدام ربع ماصة زجاجية مفتوحة مصقولة بالنار الزجاجية.

بعد ترك الأنسجة تستقر لمدة دقيقتين ، قم بتجميع المادة الطافية في أنبوب سعة 50 ملليلترا. اجمع الخلايا المنفصلة في المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي. وإعادة تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط نمو الخلايا العصبية للعد ، وتخفيف الخلايا إلى كثافة طلاء نهائية تبلغ خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة القابلة للحياة لكل مليلتر من وسط نمو الخلايا العصبية وإضافة مليلتر واحد من الخلايا إلى كل بئر من صفيحة مطلية ب 12 بئرا بولي دي ليسين.

ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا ، واستبدل نصف الوسط بحجم متساو من الوسط الطازج مرتين في الأسبوع طوال عمر الثقافة. لتقييم قدرة الخلايا العصبية المستنبتة على التعبير عن معقد التوافق النسيجي النسيجي الكبير 1 ، في اليوم المناسب للزراعة ، استبدل 0.5 مل من المادة الطافية في كل بئر ب 0.5 ملليلتر من وسط نمو الخلايا العصبية الطازجة المكملة ب 200 وحدة لكل مليلتر من الإنترفيرون بيتا لمدة ست إلى 72 ساعة في حاضنة زراعة الخلية. في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر مرة واحدة باستخدام الوسط العصبي القاعدي البارد بدون مكملات قبل إضافة 0.5 مل من الوسائط العصبية القاعدية الباردة غير المكملة بميكروغرام واحد لكل مليلتر من كتلة FC وميكروغرام واحد لكل مليلتر من الجسم المضاد المضاد ل MHC1 المترافق الفلوري لكل بئر.

بعد حضانة لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، قم بحمايته من الضوء. اغسل كل مرة جيدا مرة واحدة باستخدام Dulbeccos PBS البارد. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت لتفكك الخلايا الخالي من الإنزيم في درجة حرارة الغرفة إلى كل بئر وقم بتحريكه لطرد الخلايا.

تأكد من التفكك تحت مجهر زراعة الأنسجة المقلوب وأضف 0.5 مل من محلول FACS إلى كل بئر. قم بتقطيع الخلايا لتفريق الكتل ونقل الحجم بالكامل من كل بئر إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.7 ملليلتر. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من عازلة FACS الطازجة لكل أنبوب.

انقل كل معلق إلى آبار فردية من صفيحة قاع على شكل حرف U مكونة من 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من الكاشف المثبت إلى كل بئر. قم بترتيتوري عدة مرات لتجنب تكتل الخلايا واحتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، جهاز طرد مركزي لجمع الخلايا في قاع الآبار وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من عازلة FACS الطازجة لكل بئر.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من كاشف النفاذية المكملة بجسم مضاد مضاد للنوى العصبية المترافق في البئر. بعد الخلط ، احتضن الطبق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز محمي من الضوء. في نهاية الحضانة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ثلاث مرات ، وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من محلول FACS الطازج بين أجهزة الطرد المركزي.

بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 2٪ زوج من الفورمالديهايد في عازلة FACS مع الخلط الشامل. يمكن التعرف على الخلايا العصبية من خلال البوابات المتسلسلة للأحداث الكلية لاستبعاد الحطام الخلوي والمزدوجات ومن خلال إيجابية نواتها العصبية. يمكن بعد ذلك تحليل الخلايا الإيجابية للنوى العصبية لمزيد من الإيجابية ل معقد التوافق النسيجي الكبير 1.

من هذه البيانات ، يمكن حساب النسبة المئوية للخلايا العصبية الإيجابية لتلوين MHC1 ومتوسط شدة التألق ، مما يكشف عن أنه ، على سبيل المثال ، ينظم علاج الإنترفيرون بيتا بشكل كبير النسبة المئوية والشدة لتعبير الخلايا العصبية MHC1. مع تعديلات طفيفة ، يمكن استخدام هذه الطرق لثقافة مجموعات عصبية أخرى مثل الخلايا العصبية القشرية أو لاختبار علامات خلوية مختلفة أو جزيئات محفزة أو تعديلات جينية.