تلطيخ قائم على الأنسجة باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة

تسمح تقنية الطفو الحر للباحثين بإجراء تلطيخ قائم على الأنسجة بما في ذلك الكيمياء المناعية على أقسام الأنسجة الثابتة لتصور الهياكل البيولوجية ونوع الخلية وتعبير البروتين وتوطينه. هذه تقنية كيميائية نسيجية فعالة وموثوقة يمكن أن تكون مفيدة لفحص العديد من الأنسجة ، مثل الدماغ والقلب والكبد.

يمكن استخدام هذه التقنية العائمة المجانية لأداء الكيمياء المناعية المنخفضة على عينات أنسجة دماغ الفئران. توفر تقنية الطفو الحرة العديد من المزايا. الحصول على أقسام أنسجة أكثر سمكا ، وأداء دراسات واسعة النطاق ، باستخدام 30 إلى 40 شريحة لكل حصة وتخزين العينات على المدى الطويل.

إذا كنت تجرب هذه التقنية لأول مرة ، فننصحك بالتدرب على تركيب أقسام ليست حاسمة لتجربتك للحصول على خبرة في الطريقة. قبل التقسيم بساعة إلى ساعتين على الأقل ، قم بتأقلم العينات ذات الأهمية في ناظم البرد عند درجة حرارة قطع الأنسجة المناسبة. عندما تكون الأنسجة جاهزة.

استخدم ناظم البرد للحصول على أقسام بسمك 20 إلى 50 ميكرون ووضع الأقسام في إدخالات فردية في آبار مملوءة ب PBS من ستة أو 12 بئر. عندما يتم الحصول على جميع الأقسام ، قم بتغطية العينات بحوالي ستة ملليلتر لكل غسلة لمدة ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق قبل نقل كل بئر من الأقسام إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة مليلتر ، تحتوي على واحد إلى 1.5 مل من محلول التخزين لكل أنبوب. ثم قم بتخزين العينات على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تلطيخها.

لتلطيخ قسم الأنسجة ، قم بموازنة العينات مع درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة قبل صب الأقسام في إدخالات في صفيحة جديدة من ستة آبار. عندما يتم تصريف محلول التخزين بالكامل ، انقل الإدخالات إلى آبار جديدة ، تحتوي على ما يقرب من ستة ملليلتر من TBS لكل بئر لمدة ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق مع TBS طازج لكل غسلة على شاكر مداري بسرعة منخفضة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير ، أضف سبعة ملليلتر من محلول مانع النفاذية المحضر حديثا إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة على الخلاط في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر لكل إدخال وانقل جميع الأقسام في كل إدخال إلى أنبوب ملليلتر مناسب. ثم ضع الأنابيب على خلاط دوار. أضف حوالي سبع دورات في الدقيقة لحضانة ليلية عند أربع درجات مئوية.

في صباح اليوم التالي ، قم بصب الأقسام من كل أنبوب في إدخالات بئر فردية في صفيحة جديدة من ستة آبار واغسل الأقسام مرتين لمدة 30 ثانية لكل غسلة ومرة واحدة لمدة 10 دقائق في TBS طازج لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير، انقل مجموعات الأقسام إلى أنابيب فردية من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة ملليلتر، تحتوي على مليلتر واحد من محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لكل أنبوب واحتضان العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري بسرعة منخفضة، محمي من الضوء. في نهاية الحضانة ، صب الأقسام في إدخالات في صفيحة جديدة من ستة آبار واغسل العينات مرتين لمدة 30 ثانية ومرة واحدة لمدة 15 دقيقة في TBS طازج لكل غسلة ، محمية من الضوء.

بعد الغسيل الأخير ، قم بصب الأقسام في غرفة نسيجية زجاجية مستطيلة الشكل ، ثلاثة أرباعها مملوءة ب TBS واغمر شريحة زجاجية في TBS. باستخدام فرشاة رسم دقيقة ومصباح مكبر إذا رغبت في ذلك ، قم بإقناع الأقسام بعناية باتجاه الشريحة واضغط برفق على قسم على الشريحة ، مع التأكد من عدم وجود تجاعيد أو طيات. عندما يتم التقاط جميع الأقسام على شريحة ، اترك الشرائح تجف لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، حتى تصبح الأقسام معتمة وقم بتطبيق وسيط تركيب مائي مناسب على الأقسام.

استخدم الملقط لوضع زلة غطاء على الوسط واستخدم قطعة من ورق الترشيح للضغط بقوة على زلة الغطاء لإزالة أي وسيط زائد. يمكن بعد ذلك تصوير الأقسام باستخدام مجهر مناسب أو تخزينها في صندوق منزلق مظلم بأربع درجات مئوية. كما لوحظ في هذه الصور التمثيلية ، يمكن إجراء التحليل الكيميائي المناعي الفلوري ، باستخدام الطريقة العائمة الحرة ، على أقسام أنسجة دماغ الفئران لفحص تعبير البروتين الحمضي الليفي الدبقي.

هذا النهج مناسب أيضا للكشف عن البروتينات منخفضة التعبير ، مثل GFP ، في عينة دماغ الفأر المعدلة وراثيا منخفضة التعبير أو في بروتوكولات التلوين الكيميائي النسيجي غير الفلورية ، مثل البنفسجي الكريسيل. الأنسجة المحيطية الأخرى قابلة أيضا لاستخدام هذه التقنية دون الحاجة إلى تعديلات كما لوحظ لعينات أنسجة الكبد ذات المستوى المنخفض الذي يعبر عن GFP. أهم شيء يجب تذكره مع تقنية الطفو الحر هو أن تكون لطيفا مع الأقسام ، خاصة أثناء عمليات النقل وعندما تكون العينات على الهزازات أو الدوارات.

بالإضافة إلى تلطيخ التألق المناعي ، يمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة للبقع الكيميائية النسيجية الأخرى مثل الهيماتوكسيلين واليوزين والكريسيل البنفسجي أو للكيمياء المناعية للكروموجين.