تلطيخ قائم على الأنسجة باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة
أغسطس 25, 2020
تسمح تقنية الطفو الحر للباحثين بإجراء تلطيخ قائم على الأنسجة بما في ذلك الكيمياء المناعية على أقسام الأنسجة الثابتة لتصور الهياكل البيولوجية ونوع الخلية وتعبير البروتين وتوطينه. هذه تقنية كيميائية نسيجية فعالة وموثوقة يمكن أن تكون مفيدة لفحص العديد من الأنسجة ، مثل الدماغ والقلب والكبد.
يمكن استخدام هذه التقنية العائمة المجانية لأداء الكيمياء المناعية المنخفضة على عينات أنسجة دماغ الفئران. توفر تقنية الطفو الحرة العديد من المزايا. الحصول على أقسام أنسجة أكثر سمكا ، وأداء دراسات واسعة النطاق ، باستخدام 30 إلى 40 شريحة لكل حصة وتخزين العينات على المدى الطويل.
إذا كنت تجرب هذه التقنية لأول مرة ، فننصحك بالتدرب على تركيب أقسام ليست حاسمة لتجربتك للحصول على خبرة في الطريقة. قبل التقسيم بساعة إلى ساعتين على الأقل ، قم بتأقلم العينات ذات الأهمية في ناظم البرد عند درجة حرارة قطع الأنسجة المناسبة. عندما تكون الأنسجة جاهزة.
استخدم ناظم البرد للحصول على أقسام بسمك 20 إلى 50 ميكرون ووضع الأقسام في إدخالات فردية في آبار مملوءة ب PBS من ستة أو 12 بئر. عندما يتم الحصول على جميع الأقسام ، قم بتغطية العينات بحوالي ستة ملليلتر لكل غسلة لمدة ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق قبل نقل كل بئر من الأقسام إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة مليلتر ، تحتوي على واحد إلى 1.5 مل من محلول التخزين لكل أنبوب. ثم قم بتخزين العينات على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تلطيخها.
لتلطيخ قسم الأنسجة ، قم بموازنة العينات مع درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة قبل صب الأقسام في إدخالات في صفيحة جديدة من ستة آبار. عندما يتم تصريف محلول التخزين بالكامل ، انقل الإدخالات إلى آبار جديدة ، تحتوي على ما يقرب من ستة ملليلتر من TBS لكل بئر لمدة ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق مع TBS طازج لكل غسلة على شاكر مداري بسرعة منخفضة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير ، أضف سبعة ملليلتر من محلول مانع النفاذية المحضر حديثا إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة على الخلاط في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر لكل إدخال وانقل جميع الأقسام في كل إدخال إلى أنبوب ملليلتر مناسب. ثم ضع الأنابيب على خلاط دوار. أضف حوالي سبع دورات في الدقيقة لحضانة ليلية عند أربع درجات مئوية.
في صباح اليوم التالي ، قم بصب الأقسام من كل أنبوب في إدخالات بئر فردية في صفيحة جديدة من ستة آبار واغسل الأقسام مرتين لمدة 30 ثانية لكل غسلة ومرة واحدة لمدة 10 دقائق في TBS طازج لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير، انقل مجموعات الأقسام إلى أنابيب فردية من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة ملليلتر، تحتوي على مليلتر واحد من محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لكل أنبوب واحتضان العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري بسرعة منخفضة، محمي من الضوء. في نهاية الحضانة ، صب الأقسام في إدخالات في صفيحة جديدة من ستة آبار واغسل العينات مرتين لمدة 30 ثانية ومرة واحدة لمدة 15 دقيقة في TBS طازج لكل غسلة ، محمية من الضوء.
بعد الغسيل الأخير ، قم بصب الأقسام في غرفة نسيجية زجاجية مستطيلة الشكل ، ثلاثة أرباعها مملوءة ب TBS واغمر شريحة زجاجية في TBS. باستخدام فرشاة رسم دقيقة ومصباح مكبر إذا رغبت في ذلك ، قم بإقناع الأقسام بعناية باتجاه الشريحة واضغط برفق على قسم على الشريحة ، مع التأكد من عدم وجود تجاعيد أو طيات. عندما يتم التقاط جميع الأقسام على شريحة ، اترك الشرائح تجف لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، حتى تصبح الأقسام معتمة وقم بتطبيق وسيط تركيب مائي مناسب على الأقسام.
استخدم الملقط لوضع زلة غطاء على الوسط واستخدم قطعة من ورق الترشيح للضغط بقوة على زلة الغطاء لإزالة أي وسيط زائد. يمكن بعد ذلك تصوير الأقسام باستخدام مجهر مناسب أو تخزينها في صندوق منزلق مظلم بأربع درجات مئوية. كما لوحظ في هذه الصور التمثيلية ، يمكن إجراء التحليل الكيميائي المناعي الفلوري ، باستخدام الطريقة العائمة الحرة ، على أقسام أنسجة دماغ الفئران لفحص تعبير البروتين الحمضي الليفي الدبقي.
هذا النهج مناسب أيضا للكشف عن البروتينات منخفضة التعبير ، مثل GFP ، في عينة دماغ الفأر المعدلة وراثيا منخفضة التعبير أو في بروتوكولات التلوين الكيميائي النسيجي غير الفلورية ، مثل البنفسجي الكريسيل. الأنسجة المحيطية الأخرى قابلة أيضا لاستخدام هذه التقنية دون الحاجة إلى تعديلات كما لوحظ لعينات أنسجة الكبد ذات المستوى المنخفض الذي يعبر عن GFP. أهم شيء يجب تذكره مع تقنية الطفو الحر هو أن تكون لطيفا مع الأقسام ، خاصة أثناء عمليات النقل وعندما تكون العينات على الهزازات أو الدوارات.
بالإضافة إلى تلطيخ التألق المناعي ، يمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة للبقع الكيميائية النسيجية الأخرى مثل الهيماتوكسيلين واليوزين والكريسيل البنفسجي أو للكيمياء المناعية للكروموجين.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تُستخدم تقنية الطفو الحر (free-floating technique) لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية على مقاطع الأنسجة المثبتة، مما يسمح بتصور البنى البيولوجية، وأنواع الخلايا، والتعبير البروتيني. وتعد هذه الطريقة فعالة بشكل خاص لاستقصاء أنسجة متنوعة مثل الدماغ والقلب والكبد، وتوفر مزايا مثل الحصول على مقاطع نسيجية أكثر سمكاً وملاءمتها للدراسات واسعة النطاق.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال البحث
- علم الأنسجة
- الكيمياء النسيجية المناعية
- تحليل الأنسجة
خلفية علمية
- تتضمن مزايا تقنية القطاعات الحرة سهولة التعامل وإمكانية تخزين العينات لفترات طويلة.
- تُطبق هذه الطريقة على أنسجة بيولوجية متعددة دون الحاجة إلى تعديلات.
- تعمل هذه التقنية على تعزيز الكشف عن البروتينات ذات التعبير المنخفض في أنواع مختلفة من العينات.
الطرق المستخدمة
- التلوين الكيميائي النسيجي المناعي
- عينات من أنسجة دماغ الفأر
- المجهر الفلوري
النتائج الرئيسية
- تتيح هذه التقنية تحديد تعبير البروتين الحمضي الليفي الدبقي.
- تُظهر هذه التقنية فعالية في سياقات تعبير البروتين المنخفض، كما هو الحال في عينات الفئران المعدلة وراثياً لبروتين GFP.
- يمكن أيضاً تطبيق طرق صبغ أخرى مثل الهيماتوكسيلين والإيوسين باستخدام هذه التقنية.
الاستنتاجات
- تؤكد هذه الدراسة على تعدد استخدامات تقنية الطفو الحر (free-floating technique) في صبغ الأنسجة وتحليلها.
- من الضروري أن يتعامل الباحثون مع العينات برفق للحفاظ على سلامتها أثناء التجربة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
تتيح تقنية الكيمياء النسيجية المناعية ذات المقاطع الحرة المعالجة الفعالة للمقاطع النسيجية السميكة في الدراسات واسعة النطاق، مما يدعم التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الآلية في أبحاث العلوم العصبية وأنسجة الجسم المحيطية. ومن خلال تحسين نفاذية الأجسام المضادة والسماح بمعالجة دفعات تتراوح من 30 إلى 40 مقطعًا لكل حصة، تعزز هذه التقنية من قابلية التكرار والإنتاجية في سير عمل الاكتشاف. ويُعد هذا النهج ذا قيمة خاصة لدراسة أنماط تعبير البروتين في الأنسجة المعقدة مثل الدماغ، حيث تساهم إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للإسقاطات العصبية في تعزيز الثقة في الأهداف وتحديد أولويات المحفظة البحثية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح تصور التعبير البروتيني وتموضعه في المقاطع النسيجية السميكة، مما يدعم التحقق من الأهداف الوظيفية وتوضيح المسارات.
- القيمة التشغيلية: تسهل التعامل مع أعداد كبيرة من المقاطع لكل حصة، مما يقلل الجهد المبذول في حملات فحص المؤشرات الحيوية واسعة النطاق.
- القيمة التنبؤية: تحسن تغلغل الأجسام المضادة مقارنة بطرق التثبيت على الشرائح، مما يزيد الثقة في الكشف عن الأهداف ذات الوفرة المنخفضة مثل GFP في النماذج المعدلة وراثياً.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: متوافق مع صبغات كيميائية نسيجية متعددة، بما في ذلك الهيماتوكسيلين والإيوسين، والبنفسج الكريسيل، والكيمياء النسيجية المناعية المعتمدة على المواد الملونة، مما يتيح مرونة في تطوير المقايسات.
- القيمة التشغيلية: تظل المقاطع معلقة في المحلول أثناء الصبغ، مما يضمن تعرضاً موحداً للكاشف ويقلل من التباين بين العينات المكررة.
- القابلية للتوسع: يدعم التخزين طويل الأمد عند -80°C، مما يسمح بمعالجة الدفعات والتحليل الاسترجاعي في مسارات الاكتشاف.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: قابلة للتطبيق على كل من الجهاز العصبي المركزي والأنسجة الطرفية (مثل الكبد والقلب) دون تعديلات في البروتوكول، مما يدعم التحقق من صحة الأهداف المتقاطعة.
- تقليل المخاطر الآلية: تتيح إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للإسقاطات المحورية والشجرية، مما يوفر سياقاً هيكلياً لارتباط الهدف وتحليل المسارات.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تولد بيانات كمية ودقيقة مكانياً عن تعبير البروتين، والتي تساهم في اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف في عملية اختيار الأهداف في المرحلة قبل السريرية.
تكامل المسار وسير العمل
تندرج طريقة الطفو الحر ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من الاختبار المبكر لفرضيات الأهداف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة والتحقق من الصلاحية في المرحلة قبل السريرية، لا سيما في مجالات العلوم العصبية وتقييم السمية الجهازية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم الاستقصاء القائم على الفرضيات لأنماط التعبير البروتيني في الأنسجة المثبتة، مما يتيح رؤية ميكانيكية لبيولوجيا الهدف.
- المسح: تولد قراءات فلورية أو لونية كمية وقابلة للتكرار، ومناسبة لأنظمة التصوير الآلي ومنصات المسح القائمة على الصور.
- التحليلات: تنتج بيانات تعبير ذات دقة مكانية يمكن قياسها كمياً ومقارنتها عبر الظروف التجريبية لتقييم تعديل الهدف.
- البحث الانتقالي: تضمن الاتساق بين نماذج الاكتشاف والنماذج قبل السريرية من خلال تطبيق بروتوكولات صبغ متطابقة عبر الأنواع وأنواع الأنسجة المختلفة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تمثل منصة معيارية وقابلة للتكيف للتحليل النسيجي يمكن تطبيقها عبر مشاريع ومجالات علاجية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز حساسية ونوعية الكشف في الكيمياء النسيجية المناعية، مما يقلل من النتائج السلبية الكاذبة في دراسات التحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توحد إجراءات التعامل مع الأنسجة وعمليات الصبغ، مما يحسن إمكانية إعادة الإنتاج بين المختبرات ويقلل التباين التقني.
- القيمة الاستراتيجية: تزيد من الإنتاجية في الفحص القائم على علم الأنسجة، مما يخفض التكلفة لكل عينة ويسرع دورات تقليل المخاطر المتعلقة بالأهداف.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد أولويات الأهداف بناءً على البيانات من خلال توفير قراءات نسيجية موثوقة ومتعددة المعايير تساهم في تحديد المعقولية البيولوجية وهوامش السلامة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الأنسجة، وتقطيع الأنسجة، وطرق الكشف عن التألق المناعي أو الكشف اللوني.
- يعتمد على توفر جهاز التجميد (cryostat)، والميكروتوم، والهزازات المدارية، والخلاطات الدوارة، ومجاهر التألق أو مجاهر الحقل المضيء.
- يستلزم استخدام محاليل منظمة للحجب، والنفاذية، والغسيل لتقليل الارتباط غير النوعي وضمان اتساق الصبغ.
- يتطلب تحسين تركيزات الأجسام المضادة وأوقات الحضانة لكل هدف ونوع نسيج، خاصة بالنسبة للبروتينات ذات الوفرة المنخفضة.
- يتطلب تعاملاً دقيقاً ورفيقاً مع المقاطع العائمة لمنع التلف الميكانيكي أثناء خطوات النقل والحضانة.
