تحميل عينة المبردة في زاوية سحرية الغزل مطياف الرنين المغناطيسي النووي الذي يحافظ على الجدوى الخلوية

لنا حساسية التحليل الطيفي MAS NMR بمساعدة DNP بتوصيف البروتينات داخل الخلايا السليمة بتركيزها الداخلي. يتطلب هذا التطبيق معالجة دقيقة للعينة. يتم الحفاظ على بعض الأشكال والخلايا قابلة للحياة عندما يتم نقلها بالتبريد إلى مقياس الطيف باستخدام هذا البروتوكول.

يمكن أن يتسبب إدخال الدوار البارد في تراكم الرطوبة والجليد ، مما قد يمنع ميكانيكيا دوران العينة. سيوجه هذا العرض التوضيحي التجارب لإجراء النقل المبرد بثقة. للبدء ، ضع وسادة مصنوعة من قطعة من المناديل الورقية أو منشفة ورقية تحت الغطاء وفي أسفل القارورة المبردة.

ضع دوار الياقوت مقاس 3.2 ملم في القارورة المبردة المبطنة بالمناديل الورقية ، بحيث يكون الطرف المحدد مواجها لأسفل القارورة. قم بتجميد الدوار ببطء عن طريق وضع القارورة في حاوية تبريد ذات معدل متحكم فيه ووضع الحاوية في ثلاجة 80 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات على الأقل. انقل القارورة المبردة التي تحتوي على الدوار المجمد إلى قارورة مفرغة صغيرة مملوءة بالنيتروجين السائل.

استخدم قارورة التفريغ لنقل العينة إلى منشأة مطياف. املأ قارورة فراغ رغوة جافة ومعزولة حراريا وواسعة الفم ب 500 مل إلى لتر واحد من النيتروجين السائل. خذ القارورة المبردة من قارورة النقل واحتفظ بها فوق سطح النيتروجين السائل مباشرة لحمايتها من الغلاف الجوي.

أثناء الإمساك بالقارورة المبردة مع توجيه فم القارورة إلى أسفل قليلا ، قم بفك الغطاء ، واترك الدوار ينزلق إلى حمام النيتروجين السائل. قم بتبريد أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل مسبقا عن طريق غمره في النيتروجين السائل. تحت سطح حمام النيتروجين السائل ، استخدم الملقط لنقل الدوار إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق بحيث يكون طرف محرك الأقراص مواجها لقاع الأنبوب والعلامات التي تواجه الفتحة.

استخدم الملقط لتثبيت الأنبوب الذي يحتوي على الدوار تحت النيتروجين السائل من رقبته. باستخدام زوج ثان من الملقط ، أمسك ماسك عينة الرنين المغناطيسي النووي فوق سطح النيتروجين السائل المائل بزاوية حادة فيما يتعلق بأنبوب الطرد المركزي الدقيق. لنقل الدوار من ماسك عينة الرنين المغناطيسي النووي إلى مطياف الرنين المغناطيسي النووي ، ضع خزانة التبريد في وضع الطرد بالضغط على الإخراج.

أدخل الطرف المفتوح لماسك عينة الرنين المغناطيسي النووي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق بينما لا يزال تحت سطح النيتروجين السائل. ارفع كل من أنبوب الطرد المركزي الدقيق وماسك عينة الرنين المغناطيسي النووي للسماح للدوار بالسقوط في ماسك العينة. هز ماسك العينات والأنبوب إذا الدوار على الحافة.

اترك أنبوب الطرد المركزي الدقيق الفارغ أعلى ماسك عينة الرنين المغناطيسي النووي لحماية الدوار من الهواء. قم بإزالة ماسك العينة الفارغ الآخر من المسبار وضعه على الأرض. انقل ماسك عينة الرنين المغناطيسي النووي الذي يحتوي على الدوار إلى الجهة الأخرى.

ثم قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق وأدخله على الفور في المسبار. قم بالإشارة إلى الشخص الذي يقوم بتشغيل خزانة التبريد بالضغط على إيقاف وإخراج وإدخال. قم بتدوير العينة إلى معدل الدوران المطلوب عن طريق ضبط ضغط تدفق المحمل والقيادة.

صب 500 مل إلى لتر واحد من النيتروجين السائل في قارورة فراغ رغوة واسعة الفم وضع الحمام تحت مطياف. اغمر القارورة المبردة الفارغة التي تحتوي على قطعة من المناديل الورقية في حمام النيتروجين السائل. قلل معدل الدوران إلى صفر كيلو هرتز عن طريق تكثيف تدفق الغاز للقيادة والمحمل ، وإخراج الدوار عن طريق التبديل إلى وضع الطرد.

مع الحفاظ على وضع الطرد قيد التشغيل ، قم بإزالة ماسك العينة من المسبار وقم بإسقاط الدوار مباشرة في قارورة الرغوة ذات الفم العريض التي تحتوي على النيتروجين السائل. باستخدام ملاقط مبردة مسبقا ، انقل الدوار إلى القارورة المبردة مسبقا تحت سطح النيتروجين السائل. قم بتبريد غطاء القارورة المبردة مسبقا عن طريق غمسها في النيتروجين السائل.

قم بإزالة القارورة التي تحتوي على الدوار والنيتروجين السائل من الحمام ، وقم بتغطية الأنبوب بالغطاء المبرد مسبقا. أعد غمر القارورة المبردة في النيتروجين السائل. يمكن نقل العينة إلى تخزين النيتروجين السائل على المدى الطويل أو تفريغها على الفور لمزيد من التحليل.

الإدخال المبرد للعينات المجمدة مسبقا من خلايا الثدييات في مطياف الرنين المغناطيسي النووي الجدوى طوال تجربة الرنين المغناطيسي النووي. باستخدام هذا البروتوكول ، فإن نفاذية التريبان الزرقاء لخلايا الثدييات بعد MAS NMR تشبه نفاذية الخلايا التي لا تتعرض لأي تغير في درجة الحرارة. إذا تم تجميد الخلايا ببطء ، ثم تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة قبل إدخالها ، فإن الجدوى الخلوية تنخفض إلى أقل من 10٪ وفي الوقت نفسه ، يدعم الإدخال المبرد للعينات المجمدة من خلايا الثدييات صلاحية الخلية طوال تجربة الرنين المغناطيسي النووي.

عند محاولة القيام بالبروتوكول ، اطلب المساعدة في الضغط على إخراج العينة وتدويرها لأعلى بحيث يمكن إدخال العينة في المسبار قبل أن ترتفع درجة حرارته ، مع التأكد من عدم إدخال أي رطوبة في المسبار مع التأكد من أن مقياس الطيف سيعمل باردا لعدة أسابيع. ينطبق هذا البروتوكول على أي نظام قد تضر فيه تقلبات درجات الحرارة بسلامة العينة ، مثل تفاعلات التجميد ، أو توصيف التفاعل الوسيط المحبوس ، وعلم الإنزيمات ، وطي البروتين.