شرائح فرس النهر الأفقية من دماغ الفأر

يسهل هذا البروتوكول تحضير شرائح دماغ الحصين الأفقية لاستخدامها في التطبيقات العلمية المختلفة. تحافظ هذه التقنية على سلامة جميع مسارات ألياف الحصين داخل شريحة واحدة من نصف الكرة الأرضية. بروتوكول الشريحة هذا مناسب بشكل مثالي لتقييم التغيرات العصبية التي تحدث في أمراض الدماغ التي تتطور وتتجلى في التلفيف المسنن.

جانب في هذا البروتوكول هو إيجاد التوازن بين التنفيذ السريع قدر الإمكان والتعامل اللطيف مع أنسجة المخ. لتحضير لتر واحد من ACSF ، اخلطي جميع المواد الكيميائية الصلبة ببطء كما هو موضح في 800 مل من الماء تحت التحريك المستمر باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي قبل التقطير ببطء في الكميات المناسبة من كبريتات المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم. ثم استخدم مقياس التناضح لضغط البخار للتحقق من صحة الأسمولية بين 305 إلى 315 مللي أوسمول وقم بفقاعة محلول ACSF باستمرار في درجة حرارة الغرفة باستخدام الكربوجين لضبط الرقم الهيدروجيني بين 7.3 و 7.4.

لتحضير 250 مل من محلول شريحة عالي السكروز ، أضف المركبات إلى 25 مل من المحلول المقطع مسبقا كما هو موضح في الجدول وتحقق من أن الأسمولية تتراوح بين 320 إلى 325 مللي أوسمول. ثم قم بفقاعة محلول شرائح السكروز عالي السكروز لمدة 10 إلى 15 دقيقة باستخدام الكربوجين لضبط الرقم الهيدروجيني بين 7.3 و 7.4 وتخزين محلول شرائح السكروز عالي السكروز لمدة 20 إلى 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتجمد جزئيا. لإعداد مساحة عمل للتشريح ، املأ غرفة الاسترداد بمحلول ACSF المكربن وضع الغرفة في حمام مائي 32 درجة مئوية.

اضبط الاهتزاز على برنامج القطع المناسب واملأ الحامل بالثلج ، وقم بتثبيته على الاهتزاز ، وقم بتوصيل شفرة بذراع الاهتزاز. استخدم ملعقة لسحق وخلط محلول شرائح السكروز عالي السكروز المجمد جزئيا حتى يتم الحصول على طين غير متجانس. ثم قم بفقاعة المحلول بالكربوجين واستخدم المحلول لترطيب قطعة من ورق الترشيح فوق طبق ثقافة مبرد مقاس 90 ملم واملأ طبق ثقافة 35 ملم على الثلج.

لحصاد الدماغ ، استخدم مقص التشريح لقطع فروة رأس فأر ذكر يبلغ من العمر أسبوعين إلى ستة أسابيع وفتح الجلسنة على طول الخيط السهمي. استخدم ملقطا منحنيا لإزالة الجمجمة حتى يصبح الدماغ بأكمله ، بما في ذلك البصيلات الشمية مرئيا ، واستخدم ملعقة لاستخراج أنسجة المخ السليمة بعناية. ضع الدماغ في طبق المزرعة مقاس 35 ملم واستخدم ماصة باستور مملوءة بمحلول شرائح عالي السكروز لإزالة أي شعر أو جزيئات دم من الأنسجة برفق.

استخدم الملعقة لنقل الدماغ النظيف إلى قطعة من ورق الترشيح المنقوع واستخدم شفرة لقطع الدماغ طوليا إلى نصفين. ضع نصفي الكرة الأرضية على الجانب الإنسي المقطوع حديثا واستخدم الشفرة لعمل قطع متوازي على الجزء العلوي الظهري لكل نصف كرة لإزالة المنطقة الظهرية لكل قطعة من الدماغ. ضع نصفي الكرة الأرضية على الجانب الظهري المقطوع حديثا بحيث يكون الجزء البطني من الدماغ متجها لأعلى وضع قطرة من الغراء الفائق على صفيحة عينة.

استخدم طرف ماصة لنشر الغراء في مساحة كبيرة لاستيعاب كلتا القطعتين من المناديل ولمس قطعة من حزام ورق الترشيح على الجانب البطني من نصف الكرة الأرضية الواحد. استخدم حزاما آخر من ورق الترشيح لتجفيف الجانب الظهري من الدماغ بعناية ووضع الجانب الظهري لنصف الكرة الأرضية لأسفل على الغراء الموجود على لوحة العينة. استخدم حزامين إضافيين من ورق الترشيح لوضع نصف الكرة الثاني على الغراء كما هو موضح للتو ووضع لوحة العينة في غرفة التقطيع.

ثم قم بتغطية الطبق بسرعة ولكن بعناية بمحلول شريحة السكروز المثلج البارد. للحصول على أجزاء من أنسجة المخ ، ضع شفرة الاهتزاز أمام الجانب الإنسي من نصفي الكرة الأرضية وارفع طاولة الاهتزاز بحيث تكون الشفرة على نفس ارتفاع الجوانب البطنية لنصفي الكرة الأرضية ، والتي تواجه الآن لأعلى. استخدم التحكم في الاهتزاز لخفض الشفرة 600 ميكرون في الاتجاه الظهري وتقطيع الأنسجة حتى يتم فصل الشريحتين الأوليين تماما عن نصفي الكرة الأرضية.

عندما يتم الحصول على أول شريحتين من الأنسجة ، اعكس اتجاه القطع وخفض الشفرة 300 ميكرون أخرى قبل التقطيع مرة أخرى. عندما يصبح الحصين مرئيا ، استخدم ماصة باستور بلاستيكية موسعة لجمع الشرائح ونقلها إلى غرفة الاسترداد في الحمام المائي. اترك الشرائح في غرفة الاسترداد المملوءة ب ACSF لمدة ساعة واحدة ، ثم ضع غرفة الاسترداد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل إجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية لعينات الأنسجة.

هنا ، يمكن ملاحظة تسجيلات محتملة مثيرة للمجال السلبي والإيجابي من شرائح منخفضة وعالية الجودة على التوالي. يظهر أثر المثال السلبي سعة كبيرة من الألياف عند إزالة الاستقطاب للألياف العصبية المحفزة والتي تكون أعلى من سعة fEPSP الفعلية بينما يوضح التتبع عالي الجودة تسديدة صغيرة من الألياف إلى نسبة fEPSP وسعة fEPSP عالية. يمكن أيضا تحليل جدوى شريحة الدماغ عن طريق رسم المنحدرات المحتملة المثيرة بعد التشابك مقابل اتساع الطائرة الليفية.

يمكن الحصول على منحنيات الإدخال / الإخراج التي تستخدم عادة لتحديد جودة الشريحة عن طريق تطبيق المحفزات الحالية المتزايدة على شريحة الدماغ ومراقبة استجابات fEPSP اللاحقة. نظرا لخصائص التوصيل دون المستوى الأمثل لأنسجة المخ المحفوظة بشكل سيئ ، تظهر شرائح الدماغ منخفضة الجودة منحنيات إدخال / إخراج منخفضة. تحتوي شرائح الدماغ القابلة للحياة على خطوط أساس مستقرة للانتقال المشبكي بينما لا يمكن استخدام شرائح الدماغ ذات خط الأساس غير المستقر لمزيد من بروتوكولات التكييف لدراسة اللدونة المشبكية لدوائر الدماغ.

يمكن أن تكون تسجيلات خط الأساس fEPSP مفيدة أيضا لمراقبة تأثيرات الدواء على الانتقال المشبكي نفسه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام شرائح الدماغ مع مؤشر الكالسيوم للحصول على تسجيلات التصوير الفلوري ودراسة تدفقات الكالسيوم في ظل ظروف أو علاجات مختلفة للشرائح. تأكد من إجراء تشريح الدماغ في غضون ما لا يزيد عن 1.5 دقيقة من التضحية وهذا لا يزال يضمن أن أنسجة المخ لا تزال لفترة وجيزة فقط بدون تبريد وإمدادات الأكسجين.

شرائح دماغ الحصين لها العديد من التطبيقات المختلفة من التقنيات البيولوجية الجزيئية إلى الفيزيولوجيا الكهربية. يسهل هذا الإجراء إجراء التحقيقات المكثفة لتشريح الحصين والعمليات العصبية.