البراز (الصغير) عزل الحمض النووي الريبي
أكتوبر 28, 2020
يعزل هذا البروتوكول الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من عينات البراز من الحيوانات والبشر. يتم استخدام مجموعة عزل miRNA التجارية مع تكيف كبير لعزل الحمض النووي الريبي النقي بكمية وجودة محسنة. تعتبر عزلات الحمض النووي الريبي جيدة لمعظم فحوصات الحمض النووي الريبي النهائية مثل التسلسل والمصفوفات الدقيقة و RT-PCR.
نقدم بروتوكولا لعزل الحمض النووي الريبي من عينات البراز لدراسة microRNAs. يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي عن البراز بجودة وكمية عالية. يقلل من الحمض النووي الريبي من الميكروبات الحية.
من المهم التأكيد على ذلك ولا يتم استخدام المخزن المؤقت الملزم في هذا البروتوكول. هذا البروتوكول بسيط ومباشر. ابدأ بتعليق 25 إلى 100 ملليغرام من عينات البراز في 600 ميكرولتر من 1X DPBS المعقم في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر.
احتضان الأنبوب الذي يحتوي على العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم يهرس الخليط بطرف ماصة سعة مليلتر واحد ودوامة جيدا. أعد تعليق الخليط في الخالط مع إعداد لدورة واحدة عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية لتحسين وزيادة كمية وجودة الحمض النووي الريبي.
أضف 600 ميكرولتر من محلول كلوروفورم الفينول الحمضي إلى العينة وقم بتدوير الخليط لمدة 60 ثانية. بدلا من ذلك ، لتحسين كمية متزايدة من الحمض النووي الريبي في المحصول ، قم بخلطها مع الخالط. قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 15 دقيقة عند 10 ، 000 × جم في درجة حرارة الغرفة لفصل الطور المائي والعضوي.
كرر الطرد المركزي حتى تصبح الواجهة مضغوطة. انقل المرحلة المائية العلوية بعناية دون إزعاج المرحلة السفلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة ملليلتر بغطاء مفصلي. أضف ACS الصف 100٪ إيثانول عند 1.25 × حجم الطور المائي المكتسب والدوامة لمدة ثلاث ثوان.
ضع خرطوشة الفلتر في أنابيب التجميع. قم بتحميل 600 ميكرولتر من كل عينة في خرطوشة المرشح المتوفرة في مجموعة عزل microRNA. جهاز طرد مركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة 90 ثانية لتصفية الخليط من خلال الخرطوشة.
ثم تخلص من المرشح. كرر هذا حتى يتم ترشيح الحجم الكامل للخليط من خلال نفس غشاء المرشح في التطبيقات المتتالية. بعد كل شيء يتم تصفية العينة.
أضف 700 ميكرولتر من محلول غسيل microRNA 1 في نفس خرطوشة الفلتر. جهاز طرد مركزي لمدة 60 ثانية لتصفية محلول الغسيل من خلال خرطوشة الفلتر. تخلص من المرشح وضع خرطوشة الفلتر على نفس أنبوب التجميع.
اغسل خرطوشة الفلتر ب 700 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 المحضر من الإيثانول 100٪ من ACS وأجهزة الطرد المركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة دقيقة. تخلص من المرشح الذي تم الحصول عليه وضع خرطوشة الفلتر في نفس الأنبوب. اغسل خرطوشة الفلتر ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 وجهاز الطرد المركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة دقيقة.
تخلص من المرشح الذي تم الحصول عليه وضع خرطوشة الفلتر في نفس أنبوب التجميع. اغسل خرطوشة الفلتر ب 250 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 المحضر من الإيثانول 100٪ من ACS وأجهزة الطرد المركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة دقيقة. تخلص من المرشح الذي تم الحصول عليه وضع خرطوشة الفلتر في نفس أنبوب التجميع.
أخيرا ، انقل خرطوشة الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد وقم بتدوير المجموعة لمدة خمس دقائق لإزالة السائل المتبقي. انقل خرطوشة الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد ثم أضف 50 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى وسط الفلتر وقم بتغطية الأنبوب. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
ثم قم بتدوير الأنبوب لمدة خمس دقائق عند 8 ، 000 × جم لاستعادة الحمض النووي الريبي في أنبوب تجميع جديد. يشير اختبار الرحلان الكهربائي القائم على الرقاقة للحمض النووي الريبي إلى أن عزلات الحمض النووي الريبي التمثيلية من براز الفئران والإنسان منخفضة أو تفتقر إلى تركيبات 18S و 28S rRNA وأن حجم عزلات الحمض النووي الريبي يقع في منطقة الحمض النووي الريبي الصغيرة. كشف الرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي الصغير الآخر مع الرحلان الكهربائي القائم على الرقاقة أن جزءا كبيرا من الحمض النووي الريبي بحجم الحمض النووي الريبي الصغير.
كان نقاء الحمض النووي الريبي المستخرج مرتفعا كما يتضح من نسبة الامتصاص 2.0 للأطوال الموجية 260 و 280 نانومتر وقيمة نسبة 1.8 للامتصاص عند 260 و 230 نانومتر. لضمان نجاح الاستخراج العضوي ، تأكد من أن الوجوه واضحة ولا تنقل إلا الطور المائي العلوي دون إزعاج المرحلة السفلية ، حتى على حساب حجم منخفض من الطور المائي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل RNA عالي الجودة من عينات البراز، مما يقلل التلوث من الميكروبات الحية. تم تصميمه لكل من العينات الحيوانية والبشرية، ويضمن عائدًا ونقاءًا مُحسّنًا للتطبيقات اللاحقة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء الدقيقة
- علم الأحياء الجزيئي
الخلفية
- عزل RNA من عينات البراز أمر بالغ الأهمية لدراسة microRNAs.
- قد تؤدي الطرق التقليدية إلى تلوث RNA الميكروبي.
- يعتبر RNA عالي الجودة ضروريًا لإجراء تحليلات دقيقة في التطبيقات اللاحقة.
- يتكيف هذا البروتوكول مع مجموعة عزل miRNA التجارية لتحسين النتائج.
هدف الدراسة
- توفير طريقة موثوقة لاستخراج RNA من البراز.
- تعزيز جودة وكمية عزلات RNA.
- تسهيل البحث على microRNAs في مختلف السياقات البيولوجية.
الطرق المستخدمة
- إعادة تعليق عينات البراز في 1X DPBS معقم.
- استخدام أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم ملليتين للمعالجة.
- تكييف مجموعة عزل miRNA التجارية.
- تقليل تلوث RNA من الميكروبات الحية.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح لـ RNA الكلي عالي الجودة من عينات البراز.
- ينتج البروتوكول المحسن RNA مناسبًا للتسلسل و RT-PCR.
- ثبت فعاليته في تقليل تلوث RNA الميكروبي.
- البروتكول بسيط ومباشر للباحثين.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لاستخراج RNA من عينات البراز.
- يعتبر RNA عالي الجودة ضروريًا للتطبيقات اللاحقة.
- يمكن أن تؤدي التكيفات مع المجموعات التجارية إلى تحسين عائد ونقاو RNA.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity RNA from fecal samples enables mechanistic de-risking in target validation by providing access to host-derived microRNAs without microbial contamination. This supports predictive confidence in biomarker discovery and pathway analysis for gastrointestinal and systemic diseases. The protocol’s scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host microRNA signatures in feces for therapeutic hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing confounding signals from living microbes in sample preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces RNA isolates suitable for sequencing, RT-PCR, and microarray applications, enabling reliable compound screening readouts.
- Operational Value: Standardized washing steps and phase separation ensure reproducibility and scalability for high-throughput assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by yielding disease-relevant small RNA profiles from animal and human fecal models.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with consistent RNA quality and quantity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical validation by providing a standardized input for omics and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by isolating host-derived RNA from complex fecal matrices.
- Screening: Enables assay readiness through high-yield, pure RNA outputs compatible with downstream analytical platforms.
- Analytics: Delivers quantitative RNA measurements with high purity (A260/A280 ~2.0, A260/A230 ~1.8) for accurate condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via species-agnostic application in mouse and human models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for fecal RNA isolation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced microbial contamination and enhanced target validation in host-microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via optimized resuspension, washing, and filtration steps.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker-driven programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable RNA-derived data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and phase separation techniques to avoid interphase disruption.
- Dependent on centrifugation equipment capable of 10,000 x g and homogenization at 4,000 rpm for sample processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample mass limits (25–200 mg) to ensure consistent aqueous phase recovery.
- Adaptation considerations include adjusting wash volumes and incubation times for varying sample types and inhibitor loads.
- Practical limitation: samples exceeding 200 mg may compromise phase separation and RNA purity due to interface instability.
