تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

إن تحديد ملامح الميكروبيوم هو الخطوة الأولى نحو تحديد دور الميكروبيوم في الصحة والمرض. هنا ، نحن وصف إجراء بسيط لعزل الحمض النووي البكتيري عالي الجودة من عينة البراز إعداد المكتبة ، وأداء 16SR RNA والتسلسل الجينومي الفوقي وتحليل البيانات الميكروبيوم. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين الجدد في مجال الميكروبيوم ، وكذلك الباحثين العاملين في مجال الميكروبيوم في إنشاء خط أنابيب الميكروبيوم في مختبرهم. ويمكن تمديد هذا البروتوكول من أجل تنميط الميكروبيوم من عينات بيولوجية أخرى مثل عينات الأنف أو الشفوي أو الجلد من البشر والحيوانات. حبة اختيار هو أهم الخطوات كما جميع الخطوات المصب تعتمد على الحمض النووي عالية الجودة. ختم السليم من لوحة الحفاظ مهم كما ختم غير مكتملة قد يؤدي إلى قمع المنتج تضخيم مما أدى إلى انخفاض نوعية البيانات تسلسل. للبدء، تعقيم صناديق المقسم مع 70٪ الإيثانول. ضع الفئران في صناديق مقسّمة معقمة واسمح لهم بالتبرز بشكل طبيعي لمدة تصل إلى ساعة واحدة. استخدام ملقط العقيمة لجمع الكريات البراز في فارغة قبل المسمى 1.5 ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. أرفق الأنبوب بشكل آمن. تعقيم ملقط مع 70٪ الإيثانول، تليها مسح الجرثومي المتاح، بعد جمع البراز من كل فأر. تزن 200 ملليغرام من الكريات البراز في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر، مع 0.1 ملليلتر حبات زجاجية، ووضع أنبوب الخرز في حبة الضرب المجانسة وتجانس العينات لمدة 45 ثانية في درجة حرارة الغرفة، بسرعة 4.5 متر في الثانية الواحدة. استخراج الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة والحمض النووي elute في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر. بعد عزل الحمض النووي، كمي الحمض النووي المعزول عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من الحمض النووي على عداد الفلور. الإعداد 16S الريبوزومية الحمض النووي الريبي تضخيم الجينات PCR1 في لوحة PCR 96-well، وذلك باستخدام حجم تفاعل ميكرولتر 25. باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 40 غرام نانو من الحمض النووي، 13.5 لتراً ميكرو من مزيج انزيم البوليميراز عالي الدقة 2X، الذي يحتوي على عازلة، بالإضافة إلى DNTPs في التمهيدي الأمامي والعاعكس. ختم لوحة PCR بشكل صحيح من أعلى إلى أسفل في جميع حواف أربعة. والطرد المركزي في 1000 مرات G في 20