تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني
أكتوبر 15, 2019
وصف هنا هو اجراء التشغيل القياسية مبسطه لتشكيل الميكروبيوم باستخدام 16s rrna metagenomic التسلسل والتحليل باستخدام الاداات المتاحة بحريه. هذا البروتوكول سوف تساعد الباحثين الذين هم جديده في مجال الميكروبيوم وكذلك تلك التي تتطلب تحديثات علي أساليب لتحقيق التنميط البكتيرية في دقه اعلي.
إن تحديد ملامح الميكروبيوم هو الخطوة الأولى نحو تحديد دور الميكروبيوم في الصحة والمرض. هنا ، نحن وصف إجراء بسيط لعزل الحمض النووي البكتيري عالي الجودة من عينة البراز إعداد المكتبة ، وأداء 16SR RNA والتسلسل الجينومي الفوقي وتحليل البيانات الميكروبيوم. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين الجدد في مجال الميكروبيوم ، وكذلك الباحثين العاملين في مجال الميكروبيوم في إنشاء خط أنابيب الميكروبيوم في مختبرهم. ويمكن تمديد هذا البروتوكول من أجل تنميط الميكروبيوم من عينات بيولوجية أخرى مثل عينات الأنف أو الشفوي أو الجلد من البشر والحيوانات. حبة اختيار هو أهم الخطوات كما جميع الخطوات المصب تعتمد على الحمض النووي عالية الجودة. ختم السليم من لوحة الحفاظ مهم كما ختم غير مكتملة قد يؤدي إلى قمع المنتج تضخيم مما أدى إلى انخفاض نوعية البيانات تسلسل. للبدء، تعقيم صناديق المقسم مع 70٪ الإيثانول. ضع الفئران في صناديق مقسّمة معقمة واسمح لهم بالتبرز بشكل طبيعي لمدة تصل إلى ساعة واحدة. استخدام ملقط العقيمة لجمع الكريات البراز في فارغة قبل المسمى 1.5 ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. أرفق الأنبوب بشكل آمن. تعقيم ملقط مع 70٪ الإيثانول، تليها مسح الجرثومي المتاح، بعد جمع البراز من كل فأر. تزن 200 ملليغرام من الكريات البراز في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر، مع 0.1 ملليلتر حبات زجاجية، ووضع أنبوب الخرز في حبة الضرب المجانسة وتجانس العينات لمدة 45 ثانية في درجة حرارة الغرفة، بسرعة 4.5 متر في الثانية الواحدة. استخراج الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة والحمض النووي elute في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر. بعد عزل الحمض النووي، كمي الحمض النووي المعزول عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من الحمض النووي على عداد الفلور. الإعداد 16S الريبوزومية الحمض النووي الريبي تضخيم الجينات PCR1 في لوحة PCR 96-well، وذلك باستخدام حجم تفاعل ميكرولتر 25. باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 40 غرام نانو من الحمض النووي، 13.5 لتراً ميكرو من مزيج انزيم البوليميراز عالي الدقة 2X، الذي يحتوي على عازلة، بالإضافة إلى DNTPs في التمهيدي الأمامي والعاعكس. ختم لوحة PCR بشكل صحيح من أعلى إلى أسفل في جميع حواف أربعة. والطرد المركزي في 1000 مرات G في 20
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة منهجية مفصلة لتحديد السمات المميزة للميكروبيوم من خلال تسلسل الميتاجينوم 16S rRNA. ويهدف هذا البروتوكول، الموجه للباحثين المبتدئين وذوي الخبرة على حد سواء، إلى تقديم رؤى حول كيفية تحقيق توصيف بكتيري دقيق باستخدام أدوات ميسرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- تحليل الميكروبيوم
- التسلسل الميتاجينومي
- التوصيف البكتيري
خلفية علمية
- دور الميكروبيوم في الصحة والمرض
- أهمية عزل الحمض النووي DNA عالي الجودة
- التطبيقات في مختلف العينات البيولوجية
الطرق المستخدمة
- بروتوكول تسلسل 16S rRNA
- تحضير عينات البراز واستخلاص DNA
- استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة مجانًا للتحليل
النتائج الرئيسية
- عزل ناجح للحمض النووي البكتيري عالي الجودة
- تحضير قوي للمكتبة لغرض التسلسل
- إرشادات مفصلة للباحثين لإنشاء مسارات تحليل الميكروبيوم
الاستنتاجات
- تقدم الدراسة بروتوكولاً شاملاً لتوصيف الميكروبيوم.
- تعزز الدراسة فهم منهجيات الميكروبيوم ذات الصلة بأبحاث الصحة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُعد توصيف الميكروبيوم خطوة أساسية في التحقق من الأهداف العلاجية للأمراض الالتهابية والأيضية، مما يسمح بصياغة فرضيات حول مساهمات الميكروبات في الإمراض. يدعم هذا البروتوكول تطوير النماذج قبل السريرية من خلال توفير بيانات تصنيفية عالية الدقة من عينات بيولوجية معقدة، مما يسهل تقليل المخاطر الميكانيكية للتدخلات التي تستهدف الميكروبيوم. كما يعزز سير العمل الموحد الاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف إلى تحديد المركبات الرائدة في البرامج العلاجية المعدِّلة للميكروبيوم.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط مجموعات بكتيرية محددة بالأنماط الظاهرية للمرض في النماذج قبل السريرية.
- القيمة التشغيلية: توفر توصيفاً قابلاً للتكرار للمجتمعات الميكروبية لدعم جهود تحديد أولويات الأهداف وتوضيح المسارات.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تُنتج مخرجات تصنيفية كمية وعالية الدقة مناسبة لعمليات توحيد المقايسات ومبادرات اكتشاف المؤشرات الحيوية.
- القيمة التشغيلية: تؤسس لمسار عمل قابل للتطوير وإعادة الاستخدام لفحص تغيرات الميكروبيوم عبر أنواع مختلفة من العينات وظروف علاجية متنوعة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم توصيف الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال تمكين التتبع الطولي لتحولات الميكروبيوم استجابةً للمرشحات العلاجية.
- القيمة التشغيلية: يسهل التعاون متعدد الوظائف من خلال توحيد تنسيقات البيانات وأدوات التحليل مثل DADA2 وPhyloseq.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن سير عمل الاكتشاف المبكر من خلال تقديم بيانات قابلة للتنفيذ حول الميكروبيوم، والتي تساهم في توجيه عملية اختيار الأهداف والدراسات الميكانيكية قبل مرحلة تحسين المركبات الرائدة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال التحديد التصنيفي الدقيق على مستوى الجنس والنوع.
- الفحص: توفر ملفات ميكروبية قابلة للتكرار وجاهزة للمقايسة، مما يتيح مقارنة موثوقة للظروف التجريبية.
- التحليلات: توفر متغيرات تسلسل كمية ومقاييس للتنوع تدعم المقارنة الإحصائية والارتباط بالمؤشرات الحيوية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال تمكين المراقبة المتسقة للميكروبيوم عبر مراحل الدراسة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس قدرة معيارية مشتركة بين الأقسام لتحليل الميكروبيوم قابلة للتطبيق على مجالات علاجية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي في التفاعلات بين المضيف والميكروب.
- القيمة التشغيلية: تضمن إمكانية التكرار والقابلية للتوسع من خلال تحليل المعلوماتية الحيوية وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) القياسي المكون من خطوتين.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين الكشف المبكر عن العوامل المربكة التي يتوسطها الميكروبيوم في نماذج الأمراض.
- تأثير المحفظة: تدعم التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال توفير رؤى قائمة على البيانات حول صلاحية الآلية المستهدفة في الميكروبيوم.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في البيولوجيا الجزيئية والمعلوماتية الحيوية لإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتحليل القائم على DADA2.
- يعتمد على إمكانية الوصول إلى بنية تحتية لتسلسل الجيل القادم وموارد حوسبة لمعالجة البيانات الميتاجينومية.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق في التعامل مع العينات، واستخلاص DNA، وتحضير مكتبات التسلسل.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند توسيع نطاق البروتوكول ليشمل عينات بيولوجية غير برازية، مثل عينات الفم أو الجلد.
- يشمل قيوداً عملية تتعلق بانحياز PCR وعمق التسلسل، مما يؤثر على اكتشاف الأصناف ذات الوفرة المنخفضة.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية البيولوجية
Chapters in this video
0:04
Title
1:25
Extraction of DNA from Fecal Sample
2:29
16S rRNA Gene Amplification (PCR1) and DNA Library Construction (PCR2)
3:57
Clean-up of Indexed PCR (PCR2) and Quantification
6:03
Sequence Analysis
7:49
Results: Quality Profile and Statistical Analysis
9:29
Conclusion
![التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F206.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A06.917Z&w=384&q=75)