طريقه لأعاده البناء 3D وتحليل الواقع الافتراضي للخلايا العصبية والخلايا الددالي
سبتمبر 28, 2019
تم تصميم خط الأنابيب الموصوف لتقسيم مجموعات البيانات المجهرية الكترون أكبر من غيغابايت ، لاستخراج مورفولوجيس الخلية الكاملة. وبمجرد أعاده بناء الخلايا في 3D ، يمكن استخدام البرمجيات المخصصة المصممة حول الاحتياجات الفردية لاجراء تحليل نوعي وكمي مباشره في 3D ، وأيضا باستخدام الواقع الافتراضي للتغلب علي انسداد العرض.
من الآلي المقطع التسلسلي تقنيات المجهر الإلكتروني. معدل الحد من الخطوة في خط الأنابيب مما يؤدي إلى توليد نماذج ثلاثية الأبعاد البيولوجية معالجة الصور. يوفر بروتوكولنا إرشادات خطوة بخطوة لإنتاج بناء أكثر كثافة لأحجام الصور في غضون أيام قليلة.
جنبا إلى جنب مع نهج للقياسات الكمية باستخدام نماذج ثلاثية الأبعاد. مع هذه التقنية، يمكن تحليل بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد، بخلاف الدماغ، لتحديد العاهات الهيكلية النموذجية لبعض الأمراض ولتحسين استراتيجية التشخيص. تجزئة خطوة شاقة.
خذ الوقت لجعلها دقيقة قدر الإمكان لتجنب التدقيق في تجزئة سيئة والاضطرار إلى إعادة تشغيل العملية بأكملها. تصميم البرنامج في بعض الأحيان ليست سهلة الاستعمال جدا. لذلك، من المهم أن نرى بدء العمل على التجزئة.
فتح كومة الصورة عن طريق سحب وإسقاط الملف الأصلي من المجهر الذي يحتوي على المكدس أو شراء سحب وإسقاط المجلد الذي يحتوي على كومة الصورة بأكملها في إطار البرنامج بمجرد فتح المكدس انتقل إلى الصورة، خصائص، للتأكد من حجم voxels قد تمت قراءتها من البيانات الوصفية. تحويل الصورة إلى 8 بت عن طريق النقر على الصورة، اكتب، وحدد 8 بت. إذا تم الحصول على المكدس الأصلي كبلاط مختلفة، تطبيق خياطة داخل TrakEM2.
إنشاء مشروع جديد TrakEM2 باستخدام جديد، TrakEM2 باستخدام TrakEM2 وظائف جزءا لا يتجزأ هياكل قطاع الفائدة إذا لزم الأمر. في gooey TrakEM2، انقر بزر الماوس الأيمن'على أي شيء'تحت إطار القالب، وحدد إضافة قائمة منطقة تابعة جديدة'السحب وإسقاط أي شيء'في المجلد، تحت كائنات المشروع'وشيء واحد'قد تظهر هناك. سحب وإفلات قائمة المنطقة'ا لـ أي شيء'located تحت project objects'On إطار عرض مكدس الصور، حدد Z-space'with the cursor.
ستظهر قائمة المنطقة'ة مع رقم المعرف الفريد. حدد brush'tool على رأس واستخدام الماوس لتقسيم هيكل عن طريق ملء انها cytosol على المكدس Z كله. تصدير كتلة مجزأة، لاستخدامها في Ilastik كبذور للنحت.
للقيام بذلك، انقر بزر الماوس الأيمن'ً على كائن قائمة المنطقة في قائمة مساحة Z أو على القناع في منفذ العرض، وحدد قائمة export'area'كتسميات T-I-F. اعتماداً على الدقة المطلوبة لإعادة بناء مزيد من، تقليل حجم بكسل من كومة الصورة عن طريق أخذ عينات لأسفل. النظر في متطلبات الذاكرة من البرامج التي سيتم استخدامها لتجزئة وإعادة الإعمار.
Ilastik يعالج مكدسات تصل إلى خمسمائة بكسل على X-Y. تأخذ في الاعتبار، الحد الأدنى لحجم الذي الكائنات لا يزال يبدو التعرف عليها وبالتالي يمكن تقسيمها. استخدام image'adjust size'لتعزيز التباين والمساعدة في تجزئة، يمكن تطبيق مرشح قناع unsharp لجعل الأغشية هش.
استخدم process'filters'unsharp mass'تصدير رصة الصور كصور مفردة'للمعالجة الإضافية في برنامج تجزئة، باستخدام ملف'حفظ كتسلسل الصورة'، واختر تنسيق TIFF'. في gooey Ilastik الرئيسي، حدد نحت'وحدة. تحميل كومة الصور، باستخدام إضافة جديد'وإضافة وحدة تخزين 3D/4D واحدة من تسلسل 'تحديد الدليل كله'، واختيار المجلد الذي يحتوي على كومة الصور المحفوظة كملفات واحدة'في أسفل النافذة الجديدة، حيث تتوفر خيارات لتحميل الصور، تأكد من إبقاء Z "المحدد.
للخطوات التالية، يمكن العثور على جميع العمليات والأزرار على الجانب الأيسر من gooey البرنامج الرئيسي. ضمن علامة التبويب المعالجة المسبقة، استخدم الخيارات القياسية التي تم تحديدها بالفعل. استخدم الفلاتر الغنية باللخطوط'، والاحتفاظ بمقياس التصفية عند 1.600.
هذا المحيط يمكن تعديله بعد ذلك. بمجرد الانتهاء من المعالجة المسبقة، حدد الصفحة التالية في القائمة المنسدلة لوحدة وضع العلامات. كائن واحد وخلفية واحدة موجودان بشكل افتراضي.
حدد بذرة الكائن عن طريق النقر عليه ورسم خط على رأس هيكل الفائدة. ثم حدد بذر الخلفية وارسم سطر واحد أو عدة أسطر خارج الكائن لإعادة بنائه. الآن، انقر على قطعة 'وانتظر.
اعتماداً على طاقة الكمبيوتر وحجم المكدس، يمكن أن يستغرق تجزئة من بضع ثوان إلى ساعات. بمجرد الانتهاء من ذلك، يجب أن يظهر قناع شبه شفاف يبرز التقسيم على أعلى الهيكل المجزأ. قم بالتمرير عبر المكدس للتحقق من التجزئة.
قد لا يكون التقسيم دقيقًا إذا لم يتبع بنية الاهتمام أو انسكاب منه. تصحيح أي تسرب من خلال وضع البذور الخلفية على تجزئة انسكاب. وإضافة بذرة كائن على الجزء غير المعاد بناؤها من الهدف من الفائدة.
قد يكون التدقيق البصري الدقيق لتجزئة Ilastik مملًا ولكن من الضروري التأكد من أن الكائنات المصدرة لا تحتوي على أشياء ملموسة. إذا كان تجزئة لا يزال غير صحيح، حاول تعديل مع المعلمة bias'التي ستزيد أو تقلل من مقدار بكسل غير مؤكد المصنفة المقبولة. القيمة هي 0.95 بشكل افتراضي.
إنقاصه للحد من أي امتداد أو زيادة إذا كان تجزئة متحفظة جدا. احتمال آخر هو النقر على المعالجة المسبقة 'وتعديل حجم المرشح. زيادة قيمة سوف تقلل من الملح والفلفل مثل آثار الضوضاء، ولكن أيضا سيجعل الأغشية أكثر ضبابية وأصغر تفاصيل أصعب للكشف.
وقد يحد ذلك من التداعيات. كرر قدر ما تحتاج طالما تم تقسيم كافة الكائنات المطلوبة. بمجرد الانتهاء من كائن، انتقل إلى مقطع'وانقر على حفظ الكائن الحالي'سوف تظهر بذور جديدة اثنين لبدء تجزئة كائن جديد.
سطح مجردة التدابير على الفور كما O - باء - J الملفات عن طريق النقر على تصدير جميع meshes'to تصور نماذج مجزأة يدويا في 3D داخل TrakEM2 ، انقر بزر الماوس الأيمن ، ثم حدد تظهر في 3D'A قيمة أعلى سوف تولد شبكة دقة أقل. وأخيرا، تصدير شبكة 3D كما WaveFront O-B-J'باختيار من السطوح file'export القائمة'WaveFront'After تثبيت مجموعة أدوات مورف العصبية كما هو موضح في بروتوكول النص، خلاط مفتوح. استيراد الكائنات باستخدام استيراد المجموعة مورف العصبية بالنقر فوق استيراد objects'تحت قائمة المشهد لاستيراد كائنات متعددة في وقت واحد.
تأكد من تفعيل، واستخدام إعادة شبكة وتظليل سلس. حدد موضع الاهتمام من خارج بطانة وتعديل عمق Octree من وظيفة إعادة شبكة تحت قائمة المعدل. العمل بشكل متكرر لتقليل عدد القمم وتجنب فقدان التفاصيل في القرار والمورفولوجيا الصحيحة.
عند تغيير عمق Octree ، فإن الشبكة على gooey الرئيسية تتغير وفقا لذلك. بمجرد الانتهاء، انقر فوق تطبيق لإنهاء العملية. انتقل إلى القائمة مورف العصبية على اللوحة اليسرى واستخدام الصورة superimposition أداة التفاعلات كومة صورة لتحميل كومة الصورة.
تأكد من إدخال الحجم الفعلي للكومة الصورة ل X و ص و Z وحدد مسار المكدس بالنقر على مصدر Z.X و Y هي مستويات متعامدة. وهي اختيارية وسيتم تحميلها فقط إذا كان المستخدم إدراج مسار صالح. ثم حدد شبكة على منفذ العرض بالنقر بزر الماوس الأيمن فوقه.
أدخل وضع التحرير عن طريق الضغط على علامة التبويب، وحدد رأس واحد أو أكثر باستخدام الماوس بزر الماوس الأيمن وانقر أخيرا على إظهار الصورة في القمة. واحد أو أكثر من الطائرات قطع مع micrograph سوف تظهر فوق فوق شبكة. حدد مستوى القطع بالنقر بزر الماوس الأيمن عليه.
ثم اضغط على التحكم Y ثم انتقل فوق النموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام تمرير الماوس. يمكن استخدام هذا أيضاً كأسلوب تدقيق. يظهر هنا هو تجزئة وإعادة الإعمار باستخدام TrakEM2 و Ilastik.
يظهر gooey TrakEM2 مع الكائنات مقطعة يدويا باللون الأحمر. ويمكن بعد ذلك استخدام القناع المصدر كمدخلات للتجزئة شبه المؤتمتة. من Ilastik، يمكن تصدير أقنعة إلى TrakEM2 لمزيد من التدقيق اليدوي.
ويمكن تصدير الأقنعة كشبكات ثلاثية الأبعاد للكشف عن الهياكل المعاد بناؤها. في هذا المثال، تم إعادة بناء أربعة خلايا عصبية، الخلايا الفلكية، ميكروجليا و بيريكيت باستخدام هذه العملية. يتم عرض تحليل ثلاثي الأبعاد للورفورولوجيا المعاد بناؤها باستخدام أدوات مخصصة.
هنا هو حجم الصورة متساوي التروبيك من شعاع أيون مركزة مسح الإلكترون المجهري مجموعة البيانات. إعادة بناء كثيفة لهذه البيانات يكشف عن محاور عصبية، وعملية الفلكية وdendrites. يعرض هذا الميكروفوغراف أمثلة لأهداف القياسات الكمية مثل نقاط الاشتباك العصبي وحبيبات الجليكوجين الفلكية.
القناع من ذلك micrograph يظهر توزيع حبيبات الجليكوجين حول نقاط الاشتباك العصبي. يظهر هنا رسم بياني لمدخلات ومخرجات التصور البياني لنموذج امتصاص اللاكتات المشتق من الجليكوجين أو GLAM'Here ، يظهر مستخدم يرتدي واقعًا افتراضيًا أو سماعة رأس V-R أثناء العمل على إعادة البناء الكثيفة من مجموعة بيانات المجهر الإلكتروني الشعاعية الأيونية المركزة. من مجموعة فرعية من نيوريت، يمكن ملاحظة مشهد V-R غامرة.
يشير الليزر الأخضر إلى قمة GLAM'peak. أهمية أساسية لأنه يحدد الحجم الصحيح للأجسام ثلاثية الأبعاد المصدرة ويحدد قياساته يعكس حجمه الفعلي. مفهوم التصوير المقطع المسلسل، تجزئة التصوير والبناء 3D قديمة إلى حد ما.
اكتشاف التسارع التقني يؤدي إلى التقدم في colectomies في استعراض الكتب المدرسية التشريح. على الرغم من أن الطريقة قد وضعت لأبحاث الدماغ في المجهر الإلكتروني، فإنه يمكن تعميمها على أي وتقنية المجهر توليد البيانات علاوة على ذلك، أي نوع من تقنية التصوير ثلاثي الأبعاد يمكن أن تستفيد من مثل هذه تقنيات التصوير والبناء. بما في ذلك الأشعة C-T و M-R-I.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة خطًا زمنيًا مصممًا لتقسيم مجموعات بيانات كبيرة من المجهر الإلكتروني لإعادة بناء أشكال الخلايا الكاملة في ثلاث أبعاد. تمكن البرامج المخصصة من التحليل النوعي والكمي من خلال الاستفادة من الواقع الافتراضي لتحسين التصور ومعالجة مشكلات الانسداد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- المجهر الإلكتروني
- إعادة البناء ثلاثي الأبعاد
الخلفية
- يتم استخدام تقنيات التصوير المقطعي التسلسلي الآلي بالمجهر الإلكتروني.
- يهدف خط الأنابيب إلى تقصير الوقت المطلوب لتوليد النموذج البيولوجي ثلاثي الأبعاد.
- التقسيم ضروري، حيث يمكن أن تؤدي عدم الدقة إلى إعادة عمل مكثفة.
- يمكن أن يؤدي استخدام البرامج المخصصة إلى تعزيز قدرات التحليل.
غرض الدراسة
- لتطوير بروتوكول مبسط لإعادة بناء حجم الصور الكثيفة.
- للسماح بالتقييمات النوعية والكمية في ثلاث أبعاد.
- لتحليل الهياكل ثلاثية الأبعاد لأنسجة مختلفة لكشف الإعاقات المرتبطة بالأمراض.
الطرق المستخدمة
- تستخدم الدراسة التصوير المجهري الإلكتروني لإنشاء مجموعات بيانات حجمية.
- تركز الأساليب على التقسيم الدقيق للهياكل الخلوية في أكوام صور كبيرة باستخدام أدوات برمجية مختلفة.
- تشمل خطوات معالجة الصور إعداد مجموعة الصور، والتقسيم، وتصدير الكائنات للتصور ثلاثي الأبعاد.
- تشمل الخطوات الحرجة ضمان دقة حجم الفوكسل، وتطبيق الفلاتر، والتصحيح اليدوي للتقسيمات.
النتائج الرئيسية
- ينجح خط الأنابيب الآلي في إعادة بناء نماذج ثلاثية الأبعاد دقيقة من مجموعات البيانات الكبيرة.
- أظهرت طرق التقسيم قوة في التعامل مع الهياكل المعقدة.
- التحقق البصري ضروري لضمان موثوقية الكائنات المعاد بناؤها.
- يتمتع هذا النهج بتطبيقات محتملة في تشخيص الإعاقات الهيكلية في الأنسجة المختلفة.
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة منهجية أساسية لتقسيم بيانات التصوير المجهري الإلكتروني واسعة النطاق بدقة.
- يحسن خط الأنابيب الموضح الكفاءة في تحليل الهياكل البيولوجية المعقدة، مما قد يعزز استراتيجيات التشخيص.
- تشمل الآثار تعزيز فهمنا لهيكل الأنسجة في سياقات الصحة والمرض.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate 3D reconstruction of cellular ultrastructure enables mechanistic de-risking in target validation by resolving ambiguities in morphology-function relationships. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative structural readouts that inform hypothesis testing and pathway clarification. Integration of virtual reality analysis enhances reproducibility and cross-functional collaboration in preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through detailed visualization of glial and neuronal ultrastructure.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by clarifying complex morphologies that may be misinterpreted in 2D.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by identifying structural impairments indicative of disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating dense, accurate 3D models of tissue architecture.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative measurements derived from reconstructed structures.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by enabling reliable compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through analysis of structural impairments in axons, dendrites, and astrocytic processes.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking 3D morphology to functional hypotheses like the glycogen-derived lactate absorption model (GLAM).
- Strategic Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling visualization of synaptic targets and glycogen granule distribution for biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through quantitative 3D structural analysis.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing ultrastructural patterns unresolved in 2D imaging.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through quantitative outputs such as synapse and glycogen granule quantification.
- Analytics: Highlights measurements and readouts that help teams compare conditions, including structural impairments typical of certain diseases.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity and biomarker alignment via visualization of disease-related structural changes in neural and glial cells.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across microscopy techniques including CT and MRI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in glial and neuronal morphology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of 3D model generation from electron microscopy datasets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative 3D morphology analysis.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy, image segmentation, and 3D visualization software such as TrakEM2, Ilastik, and Blender.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include high-resolution EM imaging systems and computational resources for processing large image stacks.
- Cross-team standardization requirements for segmentation protocols and proofreading to ensure consistency across users and sites.
- Adaptation considerations across model systems, as the method can be generalized to any microscopy technique generating 3D data.
- Practical limitations include the tedious nature of segmentation and the need for accurate voxel size calibration to avoid measurement artifacts.
