بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية من خلال تحليل الصور ثلاثية الأبعاد للخلايا النجمية التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم التغيرات المورفولوجية التي يمكن أن تظهر في أنواع مختلفة من الخلايا ، إما في الظروف المرضية أو كتأثير لاستراتيجية التدخل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن دراسة العديد من المعلمات المرتبطة بالعمارة الخلوية في وقت واحد.

ستقوم الدكتورة مريم بودل بتوضيح هذا الإجراء بعد تحضير الشرائح للتلوين الكيميائي المناعي de أقسام الباريز عن طريق غمرها في الزيلين مرتين لمدة 10 دقائق. احتضان الشرائح لمدة 10 دقائق في كل من 99.8٪ 95٪ و 70٪ إيثانول لإعادة ترطيب الأقسام بعد الغسيل. يحتضن PBS الشرائح في تخفيف واحد إلى 1500 من البروتين الحمضي الليفي الدبقي أو محلول الأجسام المضادة الأولية GFAP عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

بعد الحضانة ، اغسل الأقسام في PB S3 مرات لمدة خمس دقائق. ثم احتضان الشرائح بمحلول أجسام مضادة ثانوية مترافقة بالفوسفاتيز القلوي من واحد إلى 100 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل القسم في PB S3 مرات لمدة خمس دقائق ، قبل أقل من 30 دقيقة من الاستخدام.

أضف قطرة واحدة من محلول الكروموجين الأحمر إلى ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للركيزة. احتضان كل شريحة في 100 ميكرولتر من هذا المحلول لمدة 15 إلى 20 دقيقة في الظلام. ثم اغسل الشرائح في PB S3 مرات لمدة خمس دقائق.

أخيرا ، قم بتلطيخ النوى باستخدام DPI المخفف من واحد إلى 500 في PBS. ضع قطرة أو قطرتين من وسط أنتيفا على القسم وأغلقها على الفور بقلة غطاء. احتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة قبل الفحص المجهري لضمان الختم.

لبدء الفحص المجهري متحد البؤر ، ضع شريحة على مرحلة المجهر وحدد الهدف 63 ×. بعد فتح برنامج الاستحواذ ، انقر فوق الإعداد الذكي في علامة تبويب الاستحواذ وحدد الطابق المناسب من أربعة. هنا ، يتم استخدام dappy و Alexa ، الطابق 5 55.

بعد ذلك ، انقر فوق أفضل إشارة ، متبوعا بتطبيق. ثم انقر فوق ضبط التعريض الضوئي للسماح للكمبيوتر بتحديد معلمات التعريض الضوئي المثلى لتحسين الصورة ، افتح نافذة القنوات وقم بتبديل الصورة إلى مباشر. اضبط التركيز إذا لزم الأمر.

ثم انقر فوق واحد au لتحسين الثقب ، واضبط الكسب للحصول على أفضل كثافة. أخيرا ، اضبط الكسب الرقمي بين اثنين وثلاثة. بعد هذا التحسين ، أوقف الصورة الحية وافتح نافذة وضع الاكتساب.

اضبط حجم الإطار بالنقر فوق X by Y وحدد 10 24 × 10 24. اختر أيضا سرعة بطيئة. بعد ذلك ، افتح علامة تبويب حساب المتوسط وحدد رقما أكبر من أو يساوي أربعة.

ثم انقر فوق الزر المفاجئ واحفظ الصورة ثنائية الأبعاد الملتقطة. لإعداد التصوير ثلاثي الأبعاد، افتح علامة تبويب الإعداد الذكي وحدد عنصر مكدس ZS، مما سيؤدي إلى فتح نافذة مكدس Zs. لتعيين الموضعين الأول والأخير ل Zack ، مرة أخرى ، انقر فوق مباشر واضبط التركيز على الموضع العلوي للخلية النجمية.

انقر فوق تعيين أولا. الآن اضبط التركيز على أدنى موضع للخلية النجمية ، وانقر فوق تعيين الأخير ، ثم أوقف المنظر المباشر. بعد ذلك ، اختر الفاصل الزمني بالنقر فوق الأمثل.

لضبط عدد الشرائح هنا ، الفاصل الزمني هو 1.01 ميكرومتر. أخيرا ، انقر فوق ابدأ وجرب الصور واحفظها بمجرد اكتمال الفحص. أيضا ، احصل على صورة ثنائية الأبعاد باستخدام هدف 10 × أو 20 ×.

لقياسات شدة التألق ، حدد أداة المستطيل أو الدائرة في نافذة الصورة وقم بتمييز منطقة للقياس لتحديد حجم ومساحة سطح نواة الخلايا النجمية جسم الخلية سوما ومنطقتها. انقل الصور ثلاثية الأبعاد إلى برنامج تحليل مناسب ، مثل Velocity 6.1 في برنامج التحليل. قم بإنشاء مكتبة جديدة واسحب جميع الصور إلى العمود الرمادي الأيسر.

حدد صورة ثلاثية الأبعاد واحدة وقم بتشغيل إحدى القنوات المكتسبة ذات الأهمية ، مثل dapi. بالنسبة للقياسات النووية، اضبط السطوع يدويا لتحسين التباين. الآن حدد قائمة الأدوات.

اختر جعل الحجم ، وإنتاج صورة ثلاثية الأبعاد واحدة من صور Zack. افتح قائمة التحرير وانقر على خصائص. تأكد من عرض خصائص X وY وZ.

بعد ذلك ، اختر أداة عائد الاستثمار اليدوي من شريط الأدوات. باستخدام الأداة المحددة ، ارسم خطا حول النواة المسماة DPI لقياس حجم ومساحة سطح نواة الخلايا النجمية. مرة أخرى ، باستخدام أداة عائد الاستثمار اليدوي ، قم بقياس حجم ومساحة سطح الخلية النجمية بأكملها عن طريق رسم خط حول سوما بعد سطح جميع الفروع.

انقر فوق قائمة القياسات في الجزء العلوي من نافذة الصورة ، واسحب العثور على الكائنات إلى أعلى النافذة وأعط اسما وصفيا للسكان ، وحدد اللون المرتبط وانقر فوق القياس ، مما سيفتح نافذة جديدة. في هذه النافذة الجديدة. اختر إما الحجم أو مساحة السطح كمعلمة وانقر فوق موافق.

لحفظ البيانات ، انقر فوق قائمة القياس وحدد إنشاء عنصر قياس. حدد عنصر قياس جديد يسمى من النافذة. أدخل اسم ملف للبيانات وانقر فوق موافق.

أخيرا ، قم بتصدير بيانات القياس إلى حزمة برامج مناسبة لإجراء التحليل الإحصائي وإنشاء مخططات البيانات. هنا ، قارن الباحثون الخلايا النجمية في أنسجة المخ الثابتة من الفئران المعالجة بأميلويد بيتا واحد 40 أو مع أميلويد بيتا واحد 40 وإيان. أدى الحقن العلاجي ببروتين الأميلويد إلى ظهور خلايا نجمية ذات فروع أكثر سمكا وأطول.

أظهرت هذه الخلايا النجمية من المعالجة إيان شكلا نجميا بفروع قصيرة ورقيقة. أظهرت الفئران المعالجة إيان أيضا انخفاضا في التألق الإيجابي للخلايا النجمية GFAP في شرائح الدماغ. كشف التحليل المورفومتري لأحجام معينة من الخلايا النجمية أن حجم جسم الخلية النجمية ومنطقة الخلايا النجمية والخلايا النجمية بالكامل قد انخفض مع علاج إيان مقارنة بعلاج الأميلويد وحده.

بمجرد إتقان هذه الصورة ، يمكن إكمال تقنية التحليل في بضع دقائق لكل خلية إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تمييز الهيكل بدقة عالية. من الأفضل التدرب على وضع علامة على هيكل الاهتمام يدويا قبل بدء التجربة بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية والأنسجة وعلم الأمراض لاستكشاف بنية الخلية في بيئة صحية أو مرضية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لقياس 12 معلمة مختلفة لخلية واحدة باستخدام صور ثلاثية الأبعاد.