بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية من خلال تحليل صور ثلاثية الأبعاد للخلايا النجمية التي تم الحصول عليها عبر المجهر البؤري. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم التغيرات المورفولوجية التي قد تظهر في أنواع مختلفة من الخلايا، سواء في الظروف المرضية أو كنتيجة لاستراتيجية تدخل معينة. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية دراسة العديد من المعاملات المرتبطة بالبنية الخلوية في آن واحد.

ستقوم الدكتورة مريم بودل بشرح هذا الإجراء. بعد تحضير الشرائح للتلوين الكيميائي النسيجي المناعي، يتم إزالة البارافين من المقاطع عن طريق غمرها في الزايلين مرتين لمدة 10 دقائق. تُحضن الشرائح لمدة 10 دقائق في كل من الإيثانول بتركيزات 99.8% و95% و70% لإعادة ترطيب المقاطع بعد الغسل بـ PBS. تُحضن الشرائح في محلول الجسم المضاد الأولي للبروتين الحمضي الليفي الدبقي أو GFAP بتخفيف 1:1500 عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل.

بعد الحضن، اغسل المقاطع في محلول PB S ثلاث مرات لمدة خمس دقائق. ثم احضن الشرائح مع محلول جسيم مضاد ثانوي مقترن بإنزيم الفوسفاتاز القلوي بتركيز 1:100 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل المقطع مرة أخرى في محلول PB S ثلاث مرات لمدة خمس دقائق، قبل الاستخدام بأقل من 30 دقيقة.

أضف قطرة واحدة من محلول الكروموجين الأحمر إلى ثلاثة ملليلترات من محلول درئة الركيزة. حضّن كل شريحة في 100 µL من هذا المحلول لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة في الظلام. بعد ذلك، اغسل الشرائح في محلول PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق.

أخيراً، قم بصبغ النوى باستخدام DPI المخفف بنسبة 1 إلى 500 في PBS. ضع قطرة إلى قطرتين من وسط Antifa على المقطع، ثم قم بتغطيته فوراً بشريحة غطاء. قم بتحضين الشرائح عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة قبل الفحص المجهري لضمان إتمام عملية الختم.

لبدء المجهر البؤري (confocal microscopy)، ضع الشريحة على منصة المجهر واختر العدسة الشيئية 63 x. بعد فتح برنامج الحصول على الصور، انقر فوق الإعداد الذكي (smart setup) في علامة تبويب الحصول على الصور واختر مجموعة الفلتر المناسبة (floor of fours). في هذه التجربة، تم استخدام dappy و Alexa, floor 5 55.

بعد ذلك، انقر على best signal، ثم apply. ثم انقر على set exposure للسماح للكمبيوتر بتحديد معاملات التعريض الضوئي المثالية. ولتحسين الصورة، افتح نافذة channels وقم بتحويل الصورة إلى live. اضبط التركيز إذا لزم الأمر.

بعد ذلك، انقر فوق جسيم ذهبي واحد (au) لتحسين فتحة الثقب (pinhole)، واضبط الكسب (gain) للحصول على أفضل كثافة. وأخيراً، اضبط الكسب الرقمي بين قيمتين وثلاث. بعد هذا التحسين، أوقف الصورة المباشرة وافتح نافذة وضع الاستحواذ.

اضبط حجم الإطار بالنقر على X by Y واختيار 10 24 by 10 24. اختر أيضاً سرعة بطيئة. بعد ذلك، افتح علامة تبويب المتوسط (averaging) واختر رقماً أكبر من أو يساوي أربعة.

بعد ذلك، انقر على زر الالتقاط (snap) واحفظ الصورة ثنائية الأبعاد (2D) الملتقطة. لإعداد التصوير ثلاثي الأبعاد (3D)، افتح علامة تبويب الإعداد الذكي (smart setup) وحدد خيار مكدس ZS، مما سيؤدي إلى فتح نافذة مكدس Zs. ولتحديد الموضعين الأول والأخير لـ Zack، انقر مرة أخرى على خيار العرض المباشر (live) واضبط التركيز على الموضع العلوي للخلية النجمية (astrocyte).

انقر على set first أولاً. الآن، اضبط التركيز على أدنى موضع للخلية النجمية، وانقر على set last، ثم أوقف العرض المباشر. بعد ذلك، اختر الفاصل الزمني بالنقر على optimal.

لتحديد عدد المقاطع هنا، يكون الفاصل الزمني 1.01 micrometers. وأخيراً، انقر على بدء، ثم التجربة، واحفظ الصور بمجرد اكتمال المسح. كما يجب الحصول على صورة ثنائية الأبعاد (2D) باستخدام عدسة شيئية بقوة 10 x أو 20 x.

لقياس شدة الفلورة، اختر أداة المستطيل أو الدائرة في نافذة الصورة وحدد منطقة القياس لتقدير حجم ومساحة سطح جسم خلية نواة الخلية النجمية ونطاقها. قم بنقل الصور ثلاثية الأبعاد إلى برنامج تحليل مناسب، مثل Velocity 6.1 ضمن برامج التحليل. أنشئ مكتبة جديدة واسحب جميع الصور إلى العمود الرمادي الموجود على اليسار.

اختر صورة ثلاثية الأبعاد واحدة وقم بتفعيل إحدى القنوات المكتسبة ذات الأهمية، مثل dapi. بالنسبة للقياسات النووية، اضبط السطوع يدويًا لتحسين التباين. الآن اختر قائمة الأدوات (tools menu).

اختر "make volume"، ثم قم بإنتاج صورة ثلاثية الأبعاد واحدة من صور Zack. افتح قائمة التحرير (edit menu) وانقر على الخصائص (properties). تأكد من ظهور خصائص X وY وZ.

بعد ذلك، اختر أداة تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) اليدوية من شريط الأدوات. وباستخدام الأداة المختارة، ارسم خطاً حول النواة المحددة بـ DPI لقياس حجم ومساحة سطح نواة الخلية النجمية. ومرة أخرى، وباستخدام أداة تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) اليدوية، قم بقياس حجم ومساحة سطح الخلية النجمية بأكملها عن طريق رسم خط حول جسم الخلية مع تتبع سطح جميع التفرعات.

انقر على قائمة القياسات (measurements) في الجزء العلوي من نافذة الصورة، ثم اسحب خيار "البحث عن الكائنات" (find objects) إلى الجزء العلوي من النافذة وقم بتسمية المجموعة الأولى (population one) باسم وصفي، ثم اختر اللون المرتبط بها وانقر على "قياس" (measure)، مما سيؤدي إلى فتح نافذة جديدة. في هذه النافذة الجديدة، اختر إما الحجم (volume) أو مساحة السطح (surface area) كمعلمة للقياس ثم انقر على موافق (okay).

لحفظ البيانات، انقر على قائمة القياس واختَر عنصر إجراء قياس. اختَر عنصر قياس جديد من النافذة. أدخِل اسم الملف الخاص بالبيانات ثم انقر موافق.

أخيراً، قم بتصدير بيانات القياس إلى حزمة برمجيات مناسبة لإجراء التحليل الإحصائي وإنشاء المخططات البيانية للبيانات. هنا، قارن الباحثون الخلايا النجمية في أنسجة دماغية مثبتة من جرذان عولجت بـ amyloid beta one 40 أو بـ amyloid beta one 40 وIan. أدى الحقن العلاجي بالبروتين الأميلويدي إلى ظهور خلايا نجمية ذات تفرعات أكثر سمكاً وطولاً.

أظهرت هذه الخلايا النجمية في الحيوانات المعالجة بـ Ian شكلاً نجمياً بأفرع قصيرة ورقيقة. كما أظهرت الجرذان المعالجة بـ Ian انخفاضاً في الفلورة الموجبة لـ GFAP في الخلايا النجمية ضمن شرائح الدماغ. وكشف التحليل المورفومتري لأحجام خلايا نجمية محددة أن حجم نواة الخلية النجمية، وجسم الخلية، والخلية النجمية بأكملها، ونطاق الخلية النجمية قد انخفضت مع المعالجة بـ Ian مقارنة بالمعالجة بالأميلويد وحده.

بمجرد إتقان هذه الصورة، يمكن إتمام تقنية التحليل في غضون بضع دقائق لكل خلية إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تحديد البنية بدقة عالية. ويُفضل التدرب على تحديد البنية المستهدفة يدوياً قبل بدء التجربة بعد تطويرها.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات بيولوجيا الخلية وعلم الأنسجة وعلم الأمراض لاستكشاف بنية الخلية في الحالات الصحية أو المرضية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس 12 معيارًا مختلفًا لخلية واحدة باستخدام صور ثلاثية الأبعاد.