سير عمل "التقاط سطح الخلية" للقياس الكمي الخالي من الملصقات لبروتين سطح الخلية

يسمح لنا هذا البروتوكول بالتحقيق في المستضدات الموجودة على سطح الخلية لأنواع مختلفة من الخلايا للعثور على مستضدات خاصة بهذا النوع من الخلايا أو الأنسجة. تسمح التقنية التي نقدمها هنا بتخصيب بروتينات غشاء الخلية من محللة خلية كاملة ، في النهاية للتحليل بواسطة البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي. لذا فإن أحد التطبيقات المحددة لهذا البروتوكول هو تطبيقه على الخلايا السرطانية للبحث عن المستضدات الموجودة على سطح تلك الخلايا السرطانية وليس الخلايا الطبيعية التي يمكن أن تكون بمثابة أهداف جديدة للعلاجات المناعية للسرطان.

شيء واحد يجب ملاحظته حول هذا البروتوكول هو أنه قد يكون من المهم تحسين إدخال العينة لتجربتك التي تهمك. لذلك قد يستغرق الأمر عدة تكرارات أو معايرة للنظر في العثور على الظروف المثلى. لذا فإن عرض الإجراء سيكون أكول ، أخصائي مبتدئ من مختبرنا.

للبدء ، قم بإزالة حبيبات الخلية المجمدة المسماة بالبيوتين من 80 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج. أضف 500 ميكرولتر من 2X Lysis Buffer إلى الحبيبات ، واخلطها جيدا ، واتركها دوامة بقوة لمدة 30 ثانية. قم بتحلل الخلية على الجليد ، وقم بالطرد المركزي للمحللات عند 17 ، 200 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات أي حطام متبقي.

أثناء قيام المحللة بالطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من حبات راتنج NeutrAvidin Agarose إلى عمود ترشيح متصل بمشعب الفراغ. ضع مكنسة كهربائية لطيفة واغسل الخرزات عن طريق تدفق 3 مل من Wash Buffer 1 فوقها. قم بإزالة عمود الترشيح من مشعب الفراغ ، وقم بتغطية الجزء السفلي ، وأضف محللة الخلية الموضحة إلى العمود بالخرز.

قم بتغطية الجزء العلوي من العمود واحتضان المحللة بالخرز على دوار من طرف إلى طرف لمدة 120 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الانتهاء من حضانة المحللة ، ضع عمود الترشيح مرة أخرى على مشعب الفراغ ، وقم بتطبيق مكنسة كهربائية لطيفة. اغسل الخرزات عن طريق تدفق خمسة ملليلتر من Wash Buffer 1 فوقها.

كرر خطوة الغسيل بخمسة ملليلتر من Wash Buffer 2 و Wash Buffer 3. بمجرد تدفق Wash Buffer النهائي بالكامل عبر الخرزات ، قم بإزالة العمود من المشعب. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الليز إلى الخرزات وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 1.7 مليلتر باستخدام ماصة.

قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لتسوية الخرزات وإزالة 50 ميكرولترا من المحلول. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على شاكر كتلة الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق عند اهتزاز 1000 دورة في الدقيقة. أعد تعليق التربسين المجفف في أنبوب الهضم من المجموعة عن طريق إضافة 210 ميكرولتر من محلول التعليق وسحب التربسين لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان إعادة تعليق كل التربسين المجفف.

في نهاية حضانة الخرزة ، قم بإزالتها من شاكر كتلة الحرارة وأضف 50 ميكرولترا من محلول التربسين المعلق إلى الخرز. احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية ، ورج عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة على الأقل لهضم البروتين. بمجرد اكتمال عملية الهضم ، انقل المحلول الذي يحتوي على الخرزات إلى عمود دوران وأدخل العمود في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 1.7 ملليلتر.

قم بتدوير الأنبوب لفصل محلول الببتيد المهضوم عن الخرز. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف لإيقاف تفاعل الهضم وتحمض محلول الببتيد. باستخدام محول أنبوبي ، ضع عمود تحلية المياه في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 1.7 ملليلتر.

أضف محلول الببتيد المحمض بالكامل إلى العمود. قم بتدوير العمود عند 3 ، 800 جم لمدة 3 دقائق ، بحيث يتدفق المحلول عبر العمود. تجاهل التدفق حيث أن الببتيدات مرتبطة الآن بالعمود.

أضف 200 ميكرولتر من محلول الغسيل 1 إلى العمود ، وقم بالدوران عند 3 ، 800 جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم تخلص من التدفق. كرر خطوة الغسيل مع 200 ميكرولتر من محلول Wash 2. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي صغير مرتبط بالبروتين منخفض البروتين سعة 1.7 ملليلتر.

أضف 100 ميكرولتر من محلول المذنب إلى العمود وقم بالدوران عند 3 ، 800 جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يتم الآن مسح الببتيدات من العمود إلى الأنبوب. ضع محلول الببتيد في جهاز طرد مركزي مفرغ واتركه يجف طوال الليل.

ضع الببتيدات المجففة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للقياس الكمي والتحليل على مطياف الكتلة. تم إجراء تحليل البروتين لتوصيف بروتينات سطح الخلية المخصبة باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة. تم الحصول على تركيز الببتيد النهائي البالغ حوالي 630 نانوغرام لكل ميكرولتر بناء على مقايسة القياس الكمي للببتيد اللوني.

أسفرت بيانات قياس الطيف الكتلي التي تم تحليلها باستخدام MaxQuant وتحليل مجموعة البيانات اللاحقة لبروتينات سطح الخلية عن 601 بروتين سطحي في العينة ، أي ما يقرب من 27٪ من جميع البروتينات التي تم تحديدها. يتم عرض مخطط يمثل توزيع البروتين المحدد في درجة أندروميدا هنا ، وتوضح مخطط المبعثر الارتباط بين العينة والعينة. صورت المخططات الصندوقية تباين التشغيل للتشغيل.

ومثلت مخططات التوزيع حسب العينة جودة بيانات التكرارات. أهم شيء يجب مراعاته هو مكان الببتيدات في كل خطوة. في البداية ، يكونون في محلول ، ثم يرتبطون بالخرز حتى الهضم ، ثم يكونون ملزمين بتحلية العمود حتى يتم شطبهم في النهاية.

باتباع هذا الإجراء ، هناك طرق مختلفة للتحقق من صحة عدد قليل من البروتينات المحددة ، مثل قياس التدفق الخلوي المستهدف والبروتينات المستهدفة. سيعطي هذا معلومات أكثر تفصيلا حول مستويات التعبير عن هذه البروتينات عبر العينة.