الصورة القائمة على التدفق الخلوي وتقنيات لتقييم التغيرات في الحبيبية وظيفة في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم وظيفة الخلايا المحببة كنهج من معلمتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان الخلايا المحببة أولا من عينات دم المريض بالجسيمات الحيوية والكواشف لتصور الانفجار التأكسدي. في الخطوة الثانية ، يتم حظر البلعمة بعد الحضانة ، ثم يتم تصنيف مستقبلات سطح الخلية ذات الأهمية للسماح بالتعرف الإيجابي على الخلايا الحبيبية.

في النهاية ، يمكن تحديد المجموعات الفرعية للخلايا الحبيبية المنشطة وعزلها عن طريق قياس التدفق الخلوي المستند إلى الصورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات المناعة الغذائية أو السريرية ، مثل كيف تساهم العادات الغذائية والممارسات الغذائية في التغيرات ووظيفة الخلايا المحببة. سيوضح هذا الإجراء إريك برادو ، طالب الدكتوراه من مختبري.

عند الحصول على ذوبان عينة الدم المحيطية ، يتم إذابة الجسيمات الحيوية ل SIUs و DHE في درجة حرارة الغرفة والإيثيل malamed في حمام 37 درجة مئوية B ، عندما يتم إذابة الكواشف ، أضف 20 ميكرولترا من الجسيمات الحيوية ssus إلى أربعة أنابيب فردية سعة 1.2 مليلتر داخل غطاء معقم. ثم أضف 40 ميكرولترا من DHE المذاب إلى كل أنبوب يحتوي على الجسيمات الحيوية ، واضغط برفق على الأنابيب الموجودة على المقعد لجمع الكاشف في قيعان الأنابيب. بعد إضافة 100 ميكرولتر من الدم الكامل المختلط إلى كل أنبوب، قم بإزالة أي دم ملوث على طول الحافة الداخلية للأنابيب باستخدام قضيب قطني مائل واخلط الدم والكواشف باستخدام ماصة إلكترونية لمدة ثلاث دورات.

بعد الدورة الثالثة ، ضع جميع الأنابيب في دلو ثلج محمي من الضوء. ثم احتضان الأنابيب لمدة 10 أو 20 أو 40 دقيقة في حمام بسرعة 37 درجة مئوية ، بدءا من الأنبوب الذي تبلغ مدته 40 دقيقة للتأكد من انتهاء جميع الحضانات في نفس الوقت. في نهاية الحضانات ، قم بتوزيع 15 ميكرولترا من إيثيل الملاميد في كل من الأنابيب.

بعد 30 دقيقة ، احتضن الخلايا ب 10 ميكرولتر لكل من الأجسام المضادة المناسبة. بعد ساعة أخرى ، احتضان الخلايا في 750 ميكرولتر من خلايا الدم البيضاء إصلاح محلول قمل خلايا الدم الحمراء. بعد ساعة أخرى ، تقوم الحضانة بالطرد المركزي للخلايا وشفط المادة الطافية بالفراغ ، تاركة حجم سائل متبقي يبلغ 100 ميكرولتر فوق حبيبات الخلية.

أضف الآن 10 ميكرولترات من سبعة مخففة حديثا و 50 ميكرولتر من PBS و 25 ميكرولترا من حبات المعايرة لكل عينة. ثم قم بتغطية الأنابيب ولفها بورق الألمنيوم وتخزينها على أربع درجات مئوية. عندما يكون مقياس التدفق الخلوي المستند إلى الصورة جاهزا ، قم بتشغيل كل أنبوب عينة لجمع ما لا يقل عن 3000 حدث موقع ULU باستخدام معلمات محددة مسبقا لتحليل العينات.

استخدم معالج تعويض البرامج الآلي لبرنامج IDEA لتطبيق مصفوفة تعويض على ملفات الصور الأولية وإنشاء ملفات مصورة معوضة. ثم قم بتحميل ملفات CIF الفردية في برنامج IDEA وقم بإنشاء المخططات التالية لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا الحبيبية لكل عينة مريض. باستخدام التحكم غير المحفز كمعيار مرجعي أولا ، استخدم الرسم البياني لمتوسط مربع جذر تدرج الحقل الساطع لإنشاء البوابات الأولية وتحديد الخلايا التي تم اعتبارها في بؤرة التركيز.

ثم لفصل الخلايا المفردة عن الحطام والزوجي ، قم بإنشاء مخطط نقطي لنسبة العرض إلى الارتفاع Brightfield مقابل منطقة المجال الساطع. بمجرد تحديد مجموعة نظيفة من الخلايا ، قم بإنشاء مخطط نقطي من CD 45 مقابل CD 66 B.To تحديد الخلايا الحبيبية الإيجابية CD 45 الإيجابية CD 66 B. أخيرا ، قم بإنشاء مخطط نقطي لشدة التفاصيل الساطعة للهالة مقابل شدة التفاصيل الساطعة للانفجار التأكسدي.

لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا الحبيبية المنشطة التي تجمع صور المجال الساطع في القناتين الأولى والتاسعة ، والجسيمات الحيوية في القناة الثالثة ، و DHE في القناة الرابعة ، والسبعة a a d في القناة الخامسة ، و CD 66 B في القناة 11 ، و CD 45 في القناة 12 ، يمكن أيضا إنشاء تراكب بلونين يصور أحداث DHE والجسيمات الحيوية مجتمعة. باستخدام قياس التدفق الخلوي المستند إلى الصور ، يمكن فصل مجموعة متجانسة من الخلايا الحبيبية المنشطة إلى ثلاث مجموعات فرعية مختلفة من التنشيط. باستخدام هذه الطريقة ، فإن الطريقة الأكثر فعالية لحل المجموعات الفرعية الثلاث هي رسم شدة التفاصيل الساطعة للبلعمة مقابل الانفجار التأكسدي.

الاستخدام الإضافي لمعالج التمركز في برنامج IDEAS بالقياس الكمي لوجود البلعمة المتزامنة والانفجار التأكسدي للخلايا المحببة ، وهي علامة مميزة على التنشيط العالي. بالإضافة إلى ذلك ، في هذه التجربة ، أظهرت فترة الحضانة التي استمرت 40 دقيقة أكبر نسبة من الخلايا المحببة عالية النشاط. وبالتالي ، فإن تضمين ثلاث فترات حضانة على الأقل في البروتوكول يسهل تحديد كيف يمكن لعلاج سريري معين أن يغير حالة التنشيط الزمني للخلايا الحبيبية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات تعدد الإرسال القائمة على الخرزة للإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال ، كيف يتغير إنتاج كيموكين الخلايا الحبيبية في السوبينات بعد التعرض للجزيئات الحيوية؟