طريقة عالية الإنتاجية لمراقبة الأنماط الظاهرية الحركية في Pseudomonas aeruginosa

يركز بحثنا على فهم كيفية عمل البكتيريا وكيفية تسبب العدوى باستخدام علم الأحياء النظامي والجينوميات. نهدف إلى تحديد الجينات التي تؤثر على فسيولوجيا البكتيريا في حالة تحاكي بيئة العدوى من أجل إيجاد أهداف جديدة لتطوير مضادات حيوية أفضل وعلاجات بديلة. طورنا بروتوكولا عالي الإنتاج لتحديد العوامل الجينية التي تؤثر على حركة Pseudomonas aeruginosa، مما يمكن من تحليل سلوكيات التجمع والارتعاش على مستوى الجينوم. كشفت هذه المبادرة البحثية عن آليات جزيئية تدفع الحركة تساهم أيضا في تكوين الأغشية الحيوية، والاستعمار، والتهرب من الدفاع عن المضيف.

وهو قادر على التكيف مع تحاليل وأنواع بكتيرية مختلفة. للبدء، خذ الألواح المصدرية لمكتبة المتحولين الترانسبوزيون Pseudomonas aeruginosa واتركها مسطحة على سطح بدرجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبا لتبرد. للحصول على الاختبار المطلوب، اختر صفائح M9 جلوكوز 0.5٪ أجار للهجوم الجماعي وألواح LB أجار 1٪ للارتعاش.

لتكوين المكرر لنقل مستعمرة بدقة، قم بتشغيل المكرر. في قسم وضع الاختيار والتشغيل، اختر اختر وشغل البرامج المخزنة. في قسم اختيار لوحات المصدر، اختر اللوحة الزائد 384 آغار.

ثم، في قسم اختيار اللوحة المستهدفة، اختر جمع اللوحة 384 أجار. في قسم اختيار الوسادات، اختر الدبوس القصير 384. في برامج المغنين، اختر تكرار العديد من اللاعبين، ثم اذهب إلى تكرار خيارات البرنامج واختر عام، إعادة تدوير، وغير موجود.

في المصدر القسمي، اختر الإزاحة، ثم نصف قطر عشوائي وافتراضي. في القسم المستهدف، اختر تثبيت التثبيت واضبط الضغط إلى 2٪اترك جميع الإعدادات الأخرى كالوضع الافتراضي. ثم أدخل الدبوس القصير RePads 384 في الحجرة المناسبة.

ضع لوح المصدر والهدف على المنصة المخصصة للمكرر. ضع ألواح المصدر ذات الكثافة 384 وألواح الحركة الفارغة على المنصة. اضغط زر التشغيل باستخدام المعلمات المحددة لبدء عملية النقل.

سينقل روبوت تثبيت المصفوفة الميكروبية المستعمرات من صفائح المصدر ذات الكثافة 384 إلى صفائح الحركة. بعد ذلك، ضع ألواح الحركة المقطرة داخل أكياس بلاستيكية. ضع الأكياس التي تحتوي على الألواح بعناية في الحاضنة، مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.

بعد فترة الحضانة، التقط صورا عالية الدقة لألواح الحركة باستخدام أي برنامج تصوير عالي الجودة. بعد إجراء اختبار الحركة وتصوير ألواح الحركة، شغل الماكرو في ImageJ. افتح المجلد الذي يحتوي على الصور لتحميل الدفعة للتحليل.

عند الطلب، قم بتعديل الزاوية باستخدام خيار المعاينة حتى تصبح اللوحة مستقيمة لضبط دوران اللوحة. عندما ترضح، اضغط على زر الموافق. ثم حرك أداة المستطيل حول المستعمرات لقص الجزء من اللوحة الذي يحتوي على المستعمرات.

عندما تكون جاهزا، اضغط على موافق لإكمال القص. حدد الشبكة المستخدمة لرسم منطقة الاهتمام، أو ROI، حول كل مستعمرة وقياس مساحة الحركة. اختر كثافة المستعمرة المناسبة وضبط المعايير حسب الحاجة لضمان أن كل دائرة تقع حول المستعمرة.

عندما تكون جاهزا، فعل مربع الموافقة واضغط على زر الموافق. سيتم قياس منطقة الحركة لكل مستعمرة، وسيتم حفظ ملف CSV يحتوي على البيانات في المجلد المخصص. لاختبار الحركة، استخدم محلول أجار يحتوي على M9، الجلوكوز، أحماض الكازامينو، وكبريتات المغنيسيوم.

صب 25 ملليلتر من الأجار المبرد والممزوج في كل لوح بتري. ثم قم بتلقيح كل طبق ب 2.5 ميكرولتر من الزراعة البكتيرية الليلية وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع مواجهة الأغطية للأعلى لمراقبة أنماط الحركة. بعد عمل محلول من LB مع 1٪ أجار، صب 25 ملليلتر من LB 1٪ أجار المبرد والممزوج في ألواح بيتري.

قم بحقن البكتيريا في أسفل الألواح المرتجفة التي تحتوي على 1٪ من الأجار. حضن الصحون عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة إضافية. بعد الحضانة، أزل الأجار بعناية من الأطباق.

تخيل منطقة الارتعاش عن طريق تلوين طبق بتيري بمحلول بنفسجي بنسبة 1٪. أظهر اختبار حركة الارتعاش أن طفرات Pseudomonas aeruginosa التي لديها حذف جيني من آلات T4P أظهرت مناطق هالة أصغر بكثير مقارنة بالنوع البري، مما يشير إلى انخفاض حركة الارتعاش. كشف تحليل حركة السرب أن طفرات الحذف في مكتبة PA14 قللت بشكل كبير من مناطق الهالة التي لم تكن فيها نتوءات، مما أكد عيوب في قدرة التوحيد على الجمع.

غالبا ما تكون دراسات حركة البكتيريا محدودة بسبب إنتاجيتها. سيساعد بروتوكول الحركة عالي الإنتاجية لدينا الباحثين على دراسة حركة البكتيريا بشكل شامل. على سبيل المثال، باستخدام مجموعة طفرات على مستوى الجينوم، يصبح من الممكن تحديد جميع الجينات المرتبطة بالحركة وكشف كيف تسبب البكتيريا العدوى.

تثير نتائجنا أسئلة جديدة حول التحكم الجيني في الحركة في Pseudomonas aeruginosa، ودوره في تكوين الأغشية الحيوية، وارتباطه بالممرض. كما تساعد في استكشاف كيفية تشكيل الظروف البيئية لسلوكيات الحركة، وما إذا كانت جينات الحركة المستهدفة يمكن أن تؤدي إلى علاجات مبتكرة مضادة للميكروبات.