إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة الزائفة الزنجارية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعدل المستويات داخل الخلايا للرسول الثاني cyclic-di-GMP في العامل الممرض الانتهازي ، Pseudomonas aeruginosa عن طريق شاشة المراسل الحيوي عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن الجزيئات الصغيرة التي تتداخل مع Pseudomonas aeruginosa والمعلومات الحيوية والجسيمات الأخرى عن طريق التعديل الدوري-di-GMP. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قوية للغاية ومتعددة الاستخدامات ، مما يسمح بفحص ما يزيد عن 3،500 مركب في غضون 48 ساعة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تطوير علاجات جديدة يحتمل أن تكون حساسة للزائفة الزنجارية أو الجهاز المناعي أو المضادات الحيوية الموجودة مع ممارسة ضغط أقل وانتقائي على البكتيريا. قم بتلقيح خمسة مليليات من مرق اللينجي ، أو وسط LB ، بمستعمرة واحدة من P.aeruginosa ، سبع درجات مئوية ، مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، انقل ملليلترين من المزرعة الليلية إلى 200 مل من وسط LB الطازج في قارورة سعة لتر واحد ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.

راقب الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر أو OD 600 ، كل 30 دقيقة عن طريق أخذ عينة 1 مليلتر من القارورة وفحصها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. عندما يصل OD 600 إلى ما بين 0.3 و 0.5 ، ضع 40 ملليلترا من المزرعة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلتر. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 8000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 40 مل من محلول السكروز المعقم المثلج 300 ملليمول. بعد الطرد المركزي للخلايا مرة ثانية ، قم بتعليق 20 مل من محلول السكروز المعقم المثلج 300 ملليمولار ، وقم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى وإعادة تعليقها في 400 ميكرولتر من محلول السكروز 300 ملليمول. قم بتبريد الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة ، وبعد ذلك تصبح جاهزة للتثقيب الكهربائي.

بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحدا من محلول 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر من البلازميد الذي يشفر محفز CdrA إلى الجين الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر إلى 40 ميكرولترا من الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية P.Aeruginosa المحضرة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر تم تبريده مسبقا على الجليد. امزج التعليق وانقله إلى كوفيت كهربائي بفجوة كهربائية مقاس 2 ملم مبردة مسبقا. قم بإزالة الرطوبة من السطح الخارجي للكوفيت باستخدام المناديل الورقية وضع الكوفيت في حجرة العينة الخاصة بالمثق الكهربائي.

نبض المحلول بجهد 2.5 كيلو فولت ، مكثفات 25 ميكروفاراد ومقاومة 200 أوم. أخرجي الكوفيت وأضيفي ملليلتر واحد من وسط رطل. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مليلتر واحتضانه لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.

بعد الحضانة ، انشر 10 ميكرولتر و 50 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من المزرعة على ألواح أجار LB معقمة مزودة بالأمبيسلين واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بتأكيد تعبير GFP عن طريق فحص اللوحة تحت المجهر الفلوري باستخدام قناة GFP قياسية. اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيح خمسة ملليلتر من LB. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، اخلطي 0.5 مل من المزرعة الليلية مع 0.5 مل من 50٪ من الجلسرين في أنبوب لولبي سعة 2 مليلتر وخزنيه على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قبل يومين من الشاشة ، قم بوضع سلالة P.aeruginosa المحضرة من مخزون 80 درجة مئوية تحت الصفر على صفيحة أجار LB عن طريق نشر البكتيريا برفق على اللوحة باستخدام حلقة تلقيح معقمة. احتضن الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في الليلة التي تسبق الفحص ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من P.aeruginosa من اللوحة إلى 10 ملليلتر من وسط LB في أنبوب.

احتضن ما قبل الثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. في يوم الشاشة ، قم بإعداد مزرعة فرعية من المزرعة المسبقة الليلية عن طريق تخفيفها أولا بوسط LB جديد إلى OD 600 من 1.0 ، ثم التخفيف بمزيد من 5٪ LB إلى OD 600 من 04. أضف قضيب تقليب مغناطيسي معقم في الحاوية وحرك المزرعة بأقل سرعة على محرك مغناطيسي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

هذا يسمح للبكتيريا بالتأقلم مع الوسائط قبل توزيعها في 384 لوحة بئر. لتحضير العنصر الإيجابي ، أضف 20 ميكرولترا من كبريتات توبرامايسين إلى 10 مل من المزرعة الفرعية المحضرة واخلطها برفق. ماصة 40 ميكرولتر من ثقافة التحكم الإيجابي في الآبار من A23 إلى P23.

لتحضير العنصر السلبي ، أضف 30 ميكرولترا من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى 10 مل من الزراعة الفرعية المحضرة واخلطها برفق. ماصة 40 ميكرولتر من ثقافة التحكم السلبية في الآبار من A24 إلى P24. لكل لوحة من الألواح المبللة بالجزيئات الصغيرة ، قم بتلقيح حجم 40 ميكرولترا من الثقافات المخففة بين عشية وضحاها في الآبار من A1 إلى P22.

أغلق الألواح بغطاء منفذ للهواء واحتضانها لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية. قبل حوالي 30 دقيقة من القياس الطيفي ، قم بتسخين قارئ اللوحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية لتجنب التكثيف. قم بإزالة مانع تسرب الغطاء المنفذ للهواء برفق من اللوحة قبل القراءة.

ثم قم بقياس الكثافة الضوئية بطول موجي يبلغ 600 نانومتر مع إعداد 10 ومضات لكل بئر ووقت استقرار قدره 0.2 ثانية. قبل قياس التألق ، قم بإجراء كسب تلقائي وتعديل بؤري بناء على بئر التحكم السلبي A24 وقم بتعيين قيمة هدف الكسب عند 75٪ حدد ضبط التركيز والقناة A على يمين النافذة. قم بقياس التألق من مراسل GFP بحد أقصى للإثارة يبلغ 485 نانومتر وحد أقصى للانبعاث يبلغ 520 نانومتر مع إعداد 10 ومضات لكل بئر ووقت استقرار 0.2 ثانية.

جمع البيانات من جميع اللوحات التي تم فحصها. يتم حفظ قراءات البيانات تلقائيا كإعداد افتراضي بواسطة برنامج التحكم في قارئ الألواح. لتحليل البيانات ، اعرض القراءات بالنقر فوق أيقونة المريخ داخل برنامج التحكم لفتح حزمة التحليل الإحصائي.

استرجع البيانات بالنقر المزدوج على رقم اللوحة محل الاهتمام للوصول إلى البيانات لتحليلها. تقييم توحيد الاختبار وقابليته للتكرار باستخدام تحليل Z أولي قوي. بعد ذلك ، احسب النسبة المئوية لتثبيط النمو وقم بتقييم النسبة المئوية لتثبيط المستوى داخل الخلايا ل c-di-GMP كما هو مفصل في بروتوكول النص.

يصف هذا الشكل البيانات الأولية التمثيلية ل OD 600 و GFP من الشاشة عالية الإنتاجية. تم تطبيق خريطة حرارية متدرجة ملونة بألوان ساخنة إلى باردة تشير إلى قيم منخفضة إلى عالية على قيم البئر. يتم تحليل البيانات التي تم إنشاؤها من أجل تثبيط النسبة المئوية ويتم تمثيلها هنا لكل من قراءات OD 600 و GFP.

تميل الجزيئات الصغيرة التي يحتمل أن تمنع النمو و c-di-GMP داخل الخلايا إلى أن تكون باللون الأخضر ، في حين أن الجزيئات الصغيرة التي يحتمل أن تعزز النمو ومستويات c-di-GMP داخل الخلايا تميل إلى أن تكون باللون الأحمر. يتم استخدام مخططات المبعثر لمقارنة النسبة المئوية للتثبيط الذي تم الحصول عليه من كل جزيء صغير تم اختباره. يتم تمثيل كل جزيء صغير بنقطة صغيرة ويتم عرض توزيع التثبيط المئوية لكل من قراءات OD 600 و GFP.

يتم تحديد قطع زائد أو ناقص بنسبة 50٪ لتحديد الضربة. يتم تمييز الزيارات المحتملة باللون الأحمر. يتم إجراء فحوصات استجابة الجرعة على كل مركب مثير للاهتمام.

هنا ، يتم اختبار مركبين محددين في مقايسة استجابة جرعة 10 نقاط بتركيز أعلى يبلغ ملليمولار وسلسلة تخفيف مزدوجة. أدى تركيب وظيفة لوجستية من أربع معلمات للبيانات إلى قيم تركيز مثبطة نصف قصوى لكل مركب مكون من 158 ميكرومولار و 193 ميكرومولار. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لفحص ما يزيد عن 3،500 مركب في غضون 48 ساعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص Pseudomonas aeruginosa بقوة بحثا عن المركبات التي تتداخل مع إشارات Cyclic-di-GMP. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على ظروف الفحص قابلة للمقارنة عند الفحص على مدار عدة أيام. يمكن أن يؤدي اتباع شاشة من نقطة واحدة تقوم بتشغيل شاشة استجابة dirsk باستخدام نفس البروتوكول إلى التحقق من صحة النتائج.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لتحديد الجزيئات الصغيرة المحتملة التي تتداخل مع Pseudomonas aeruginosa ثنائية المعلومات الكريمة ومقاومة المضادات الحيوية. الأهم من ذلك ، يمكن تكييف هذه التقنية لاستخدامها مع أي بكتيريا ذات أهمية ويمكن تعديلها لفحص المخرجات أو المدخلات الأخرى مثل التأثير على بقاء البكتيريا. أخيرا ، لا تنس أن العمل مع Pseudomonas aeruginosa يمكن أن يكون خطيرا.

ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية عند تنفيذ هذا الإجراء.