إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعدل المستويات داخل الخلوية للرسول الثاني cyclic-di-GMP في الممرض الانتهازي، Pseudomonas aeruginosa، وذلك عن طريق فحص حيوي عالي الإنتاجية باستخدام مراسل حيوي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن الجزيئات الصغيرة التي تتدخل في المعلومات الحيوية لـ Pseudomonas aeruginosa، وجسيمات أخرى عن طريق تعديل cyclic-di-GMP. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها قوية للغاية ومتعددة الاستخدامات، مما يسمح بفحص ما يزيد عن 3,500 مركب في غضون 48 ساعة.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو تطوير علاجات جديدة من شأنها أن تزيد من حساسية بكتيريا Pseudomonas aeruginosa تجاه الجهاز المناعي أو تجاه المضادات الحيوية الموجودة، مع ممارسة ضغط انتقائي أقل على البكتيريا. قم بتلقيح 5 mL من مرق الليسوجين (lysogeny broth)، أو وسط LB، بمستعمرة واحدة من P.aeruginosa عند 37 °C، مع الرج بسرعة 200 rpm. بعد ذلك، انقل 2 mL من المزرعة التي نمت طوال الليل إلى 200 mL من وسط LB طازج في دورق سعة 1 L، وحضنها عند 37 °C مع الرج بسرعة 200 rpm.

راقب الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر أو OD 600، كل 30 دقيقة عن طريق أخذ عينة بحجم 1 milliliter من الدورق وفحصها باستخدام جهاز spectrophotometer. عندما تصل قيمة OD 600 إلى ما بين 0.3 و0.5، ضع 40 millileters من المزرعة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 mililiter. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 8000 rpm لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 40 milliliters من محلول سكروز 300 millimolar المعقم والمبرد بالثلج. بعد طرد الخلايا مركزياً للمرة الثانية، أعد تعليقها في 20 milliliters من محلول سكروز 300 millimolar المعقم والمبرد بالثلج. اطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى وأعد تعليقها في 400 microliters من محلول السكروز 300 millimolar. برد الخلايا على الثلج لمدة 30 minutes، لتصبح بعد ذلك جاهزة للتثقيب الكهربائي.

بعد ذلك، أضف 1 µL من محلول بتركيز 0.2 µg/µL من البلازميد الذي يشفر لمحفز CdrA للجين الذي يشفر للبروتين الفلوري الأخضر إلى 40 µL من خلايا P.Aeruginosa الكهرومؤهلة المُحضرة، وذلك في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL مبرد مسبقاً على الثلج. اخلط المعلق وانقله إلى كوفيت تخثير كهربائي بفتحة قطب كهربائي تبلغ 2 mm مبردة مسبقاً. قم بإزالة الرطوبة من السطح الخارجي للكوفيت باستخدام ورق مناديل، ثم ضع الكوفيت في حجرة العينة بجهاز التخثير الكهربائي.

قم بتعريض المحلول لنبضات كهربائية بجهد 2.5 kilovolts، وسعة 25 microfarad، ومقاومة 200 ohms. أخرج الكيوفيت وأضف 1 milliliter من وسط LB. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 milliliter واحضنها لمدة ساعتين عند 37 degrees Celsius مع الرج بسرعة 200 rpm.

بعد الحضن، انشر مقادير موزعة بحجم 10 µL و50 µL و100 µL من المزرعة على أطباق LB agar معقمة ومضاف إليها Ampicillin، ثم احضن الأطباق عند 37 °C طوال الليل. تأكد من تعبير GFP بفحص الطبق تحت مجهر فلوري باستخدام قناة GFP قياسية. اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيحها في 5 mL من LB. بعد الحضن طوال الليل، اخلط 0.5 mL من المزرعة الليلية مع 0.5 mL من glycerol بنسبة 50% في أنبوب ذو غطاء لولبي سعة 2 mL واحفظه عند -80 °C.

قبل يومين من عملية الفحص، قم بنقل سلالة P.aeruginosa المُحضرة من المخزون المحفوظ في درجة حرارة 80- درجة مئوية إلى طبق أغار LB عن طريق نشر البكتيريا بلطف فوق الطبق باستخدام عروة تلقيح معقمة. قم بحضن الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. وفي المساء الذي يسبق عملية الفحص، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من P.aeruginosa من الطبق في 10 milliliters من وسط LB في أنبوب.

قم بتحضين المزرعة الأولية طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 200 rpm. وفي يوم الفرز، قم بإعداد مزرعة فرعية من المزرعة الأولية المحضنة طوال الليل عن طريق تخفيفها أولاً بوسط LB طازج حتى تصل قيمة OD 600 إلى 1.0، ثم تخفيفها بشكل أكبر باستخدام 5%LB حتى تصل قيمة OD 600 إلى 0.4. أضف قضيب تحريك مغناطيسي معقم إلى الوعاء وقم بتحريك المزرعة بأدنى سرعة باستخدام محرك مغناطيسي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

يتيح ذلك للبكتيريا التأقلم مع الوسط الغذائي قبل توزيعها في أطباق ذات 384 بئراً. لتحضير الضابط الموجب، أضف 20 microliters من Tobramycin Sulfate إلى 10 milliliters من المزرعة الفرعية المُحضرة واخلط بلطف. ثم انقل بواسطة الماصة 40 microliters من مزرعة الضابط الموجب إلى الآبار من A23 إلى P23.

لتحضير الضابط السلبي، أضف 30 µL من Dimethyl Sulfoxide إلى 10 mL من المزرعة الفرعية المُحضرة واخلط بلطف. انقل بواسطة الماصة 40 µL من مزرعة الضابط السلبي إلى الآبار من A24 إلى P24. وبالنسبة لكل صفيحة مبللة بالجزيئات الصغيرة، يتم تلقيح حجم 40 µL من المزارع الليلية المخففة في الآبار من A1 إلى P22.

أغلق الأطباق بغطاء سداد نفاذ للهواء واحضنها لمدة ست ساعات عند 37 درجة Celsius. وقبل القياس الطيفي بـ 30 دقيقة تقريبًا، قم بتسخين قارئ الأطباق مسبقًا إلى 37 درجة Celsius لتجنب التكثف. قم بإزالة غطاء السداد النفاذ للهواء برفق من الطبق قبل القراءة.

ثم قم بقياس الكثافة الضوئية عند طول موجي 600 nanometers مع ضبط الإعداد على 10 ومضات لكل بئر وزمن استقرار قدره 0.2 seconds. وقبل قياس الفلورة، قم بإجراء ضبط تلقائي للكسب والتركيز بناءً على بئر الضابط السلبي A24، واضبط قيمة الكسب المستهدفة عند 75% اختر ضبط التركيز والقناة A على يمين النافذة. قم بقياس الفلورة من المراسل GFP عند أقصى استثارة 485 nanometers وأقصى انبعاث 520 nanometers مع ضبط الإعداد على 10 ومضات لكل بئر وزمن استقرار قدره 0.2 seconds.

قم بجمع البيانات من جميع الأطباق التي تم فحصها. يتم حفظ قراءات البيانات تلقائياً كإعداد افتراضي بواسطة برنامج التحكم في قارئ الأطباق. ولتحليل البيانات، يمكن استعراض القراءات بالنقر على أيقونة Mars داخل برنامج التحكم لفتح حزمة التحليل الإحصائي.

قم باسترجاع البيانات عن طريق النقر المزدوج على رقم الطبق المطلوب للوصول إلى البيانات المخصصة للتحليل. قم بتقييم اتساق وقابلية تكرار المقايسة باستخدام تحليل Z prime القوي. بعد ذلك، احسب النسبة المئوية لتثبيط النمو وقيم النسبة المئوية لتثبيط المستوى داخل الخلوي لـ c-di-GMP كما هو مفصل في البروتوكول النصي.

يصف هذا الشكل بيانات أولية ممثلة لـ OD 600 و GFP من عملية الفحص عالية الإنتاجية. وقد تم تطبيق خريطة حرارية بتدرج لوني من الألوان الحارة إلى الباردة للإشارة إلى القيم من المنخفضة إلى العالية في الآبار. كما جرى تحليل البيانات الناتجة لحساب نسبة التثبيط، وهي ممثلة هنا لكل من قراءات OD 600 و GFP.

تميل الجزيئات الصغيرة التي من المحتمل أن تثبط النمو ومستويات c-di-GMP داخل الخلايا إلى الظهور باللون الأخضر، بينما تميل الجزيئات الصغيرة التي من المحتمل أن تعزز النمو ومستويات c-di-GMP داخل الخلايا إلى الظهور باللون الأحمر. تُستخدم المخططات المبعثرة لمقارنة نسبة التثبيط التي تم الحصول عليها من كل جزيء صغير تم اختباره. يتم تمثيل كل جزيء صغير بنقطة صغيرة، ويظهر توزيع نسبة التثبيط لكل من قراءات OD 600 و GFP.

يتم اختيار حد فاصل بنسبة ±50% لتحديد المركبات النشطة (hits). وتظهر المركبات النشطة المحتملة باللون الأحمر. ثم تُجرى مقاييس الاستجابة للجرعة على كل مركب مثير للاهتمام.

هنا، يتم اختبار مركبين محددين في مقايسة استجابة للجرعة مكونة من 10 نقاط، بتركيز أقصى يبلغ 2 millimolar وسلسلة تخفيف بمقدار ضعفين. وقد أدى تطبيق دالة لوجستية رباعية المعلمات على البيانات إلى الحصول على قيم التركيز المثبط النصفي الأقصى لكل مركب بلغت 158 micromolar و193 micromolar. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لفحص ما يزيد عن 3,500 مركب خلال 48 ساعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص بكتيريا Pseudomonas aeruginosa بدقة للبحث عن المركبات التي تتدخل في إشارات cyclic-di-GMP. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على ظروف فحص قابلة للمقارنة عند إجراء الفحص على مدار عدة أيام. ويمكن التحقق من صحة النتائج الإيجابية (hits) من خلال إجراء فحص لاستجابة الجرعة بعد إجراء فحص النقطة الواحدة باستخدام البروتوكول نفسه.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لتحديد الجزيئات الصغيرة المحتملة التي تتدخل في تدفق المعلومات الحيوية ومقاومة المضادات الحيوية في بكتيريا Pseudomonas aeruginosa. ومن المهم الإشارة إلى أنه يمكن تطويع هذه التقنية لاستخدامها مع أي بكتيريا مستهدفة، كما يمكن تعديلها لفحص مخرجات أو مدخلات أخرى، مثل التأثير على حيوية البكتيريا. وأخيرًا، لا تنسَ أن العمل مع بكتيريا Pseudomonas aeruginosa قد ينطوي على مخاطر.

ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية، عند تنفيذ هذا الإجراء.