طريقة بسيطة وفعالة لاختبار العوامل المعدلة للمناعة لتوليد الخلايا المتغصنة ذات التحمل من الخلايا الوحيدة البشرية CD14 ⁺

نسعى لفهم العلاجات المعدلة للمناعة التي يمكن أن تولد خلايا شجيرية متسامحة من الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الوحيدة المتمايزة بالفعل ، وهذا أمر ذو قيمة كبيرة لأبحاث المناعة الذاتية والزرع. أصبحت العلاجات الذاتية أكثر عملية بسبب التقدم في التصنيع وأظهرت الخلايا المتغصنة ذات التحمل نتائج واعدة في الدراسات قبل السريرية. يمكن أن تولد تسامحا محددا للمستضد. الأكثر شيوعا هو قياس الخلايا. يوفر هذا طريقة سريعة ويمكن الوصول إليها أيضا لتحليل الخلايا المتسامحة. من الصعب توليد خلايا شجيرية تحمل المنشأ تستمر في كلتا الوظيفتين في الجسم الحي. هذا هو السبب في عدم وجود علاجات الخلايا المتغصنة المعتمدة سريريا للتحمل. لقد حددنا مجموعات جديدة من المركبات المعدلة للمناعة من دراسات الفحص الكبيرة التي تظهر تحسنا في وظائف الخلايا المتغصنة المتحملة. نحن أيضا نصمم تركيبات الجسيمات النانوية المتسامحة.

[مدرب] للبدء ، ضع أنابيب سعة 15 ملليلتر تحتوي على خلايا وحيدة بشرية غنية وخلايا تائية في جهاز طرد مركزي. بعد اكتمال الطرد المركزي، استخدم ماصة لشفط المادة الطافية من الأنابيب. أضف ملليلترا واحدا من وسط استزراع MODC إلى حبيبات الخلية الأحادية ، ومليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا التائية إلى الأنبوب مع الخلايا التائية واخلطها جيدا قبل عد الخلايا. بعد ذلك ، أضف تسعة ملليلتر من وسط ثقافة MODC الدافئ إلى تعليق الخلية الأحادية لعمل الحجم النهائي البالغ 10 ملليلتر. ثم قم بتعبئة 100 ميكرولتر لكل من محاليل مخزون GM-CSF وIL-4. انقل التعليق إلى طبق بتري مكتوب عليه ، يحمل علامة MODC ، واحتضانه. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من وسط تجميد الخلايا التائية إلى تعليق الخلية التائية. يقسم الخليط إلى قارورتين بالتبريد سعة ملليلترتين. ضع قوارير التبريد محكمة الغلق في غرفة تجميد مع أنابيب موازنة في آبار غير مستخدمة. في اليوم الرابع ، أضف خمسة ملليلتر من وسط استزراع MODC الطازج إلى أنبوب الخلية الوحيدة. ثم قم بتعبئة 100 ميكرولتر لكل من محاليل مخزون GM-CSF وIL-4 سبعة واحتضانها حتى اليوم السابع. في اليوم السابع ، قم بنقل الخلايا المتغصنة المتمايزة المشتقة من الخلايا الوحيدة ، أو MDOCs ، إلى أنبوب سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي كما كان من قبل. أضف ملليلترا واحدا من وسط زراعة MODC الدافئ إلى حبيبات الخلية والماصة لأعلى ولأسفل لخلطها جيدا. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بتخفيف المعلق بوسط استزراع MODC الدافئ الذي يحتوي على GM-CSF و IL4 حتى يتم الحصول على تركيز الخلية المطلوب. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من المعلق الذي يحتوي على 30,000 خلية في كل بئر من لوحة زراعة أنسجة الآبار 96 ذات القاع المسطح. أضف ميكرولتر واحد من الأدوية المعدلة للمناعة إلى الآبار المخصصة واحتضنها. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للوحة MODC عند 300 جم لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية برفق ، أضف برفق 200 ميكرولتر من HBSS الدافئ إلى جانب اللوحة وجهاز الطرد المركزي. مرة أخرى ، أضف 100 ميكرولتر من وسط استزراع MODC الدافئ الذي يحتوي على GM-CSF و IL4 بعد الشفط الطافي. إذا تم استخدام التحفيز المناعي ، أضف ميكرولتر واحد من 100X من عديدات السكاريد الدهنية إلى الآبار المخصصة واحتضنها. في اليوم الثامن ، قم بإذابة قارورتين بالتبريد في حمام خرز ساخن عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ المحتويات في الذوبان. بمجرد إذابتها جزئيا ، انقل القوارير إلى غطاء مزرعة الخلايا. ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط زراعة الخلايا التائية الدافئة لإذابة الخلايا بسرعة. انقل المحتويات إلى أنبوب سعة 50 مليلتر واشطف قوارير التبريد بملليلتر إضافي واحد من وسط زراعة الخلايا التائية لجمع جميع الخلايا. قم بتعبئة التعليق بمحلول تلطيخ التدفق إلى 15 مل وجهاز الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من محلول تلطيخ التدفق والطرد المركزي مرة أخرى ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا التائية الدافئة بعد سحب المادة الطافية. أضف تسعة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا التائية الدافئة لعمل حجم نهائي يبلغ 10 ملليلتر. انقل المعلق إلى طبق بتري المسمى الخلايا التائية المعاد إذابتها واحتضانه. في اليوم الثامن ، قم بالطرد المركزي للوحة MODC عند 300 جم لمدة خمس دقائق. بعد سحب العينة الطافية ، أضف 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ التدفق إلى كل بئر واحتضانه. ثم قم بتدوير الماصة لأعلى ولأسفل لإزالة الخلايا المرفقة وتعليق الخلية إلى لوحة جديدة ذات قاع V سعة 96 بئر قبل الطرد المركزي مرة أخرى. ماصة 50 ميكرولترا من الجسم المضاد المثبط لربط مستقبلات FC في كل بئر بعد شفط المادة الطافية لمنع الارتباط غير المحدد. بعد احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، أضف 50 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة للوحة التحقق المحضرة في كل بئر. امزج 50 ميكرولترا من حبات التعويض مع 50 ميكرولترا من كل جسم مضاد مخفف في أنابيب سعة 1.5 مليلتر واحتضنها. الطرد المركزي اللوحة على حرارة 300 جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ التدفق لغسل الخلايا. بعد الغسيل النهائي والطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في 110 ميكرولتر من محلول تلطيخ التدفق لتحليل قياس التدفق الخلوي. بالنسبة إلى MODCs ذات التحمل ، استبدل كوكتيل الأجسام المضادة بكوكتيل لوحة التسامح. في اليوم التاسع ، انقل طبق بتري الخلية التائية المعاد إذابته إلى أنبوب سعة 50 مليلتر وقم بتعبئة الأنبوب بمحلول تلطيخ التدفق. استخدم الأنبوب الثاني الذي يحتوي على خلية تائية غير ملوثة لتحليل مثلثات. قم بتدوير الأنابيب عند 250 جم لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا الدافئة. عد الخلية التائية وتأكد من الحصول على ما لا يقل عن 4 ملايين خلية. جهاز الطرد المركزي للوحة MODC عند 300 جم لمدة خمس دقائق. بعد شفط المواد الطافية ، أضف 200 ميكرولتر من الخلايا التائية في كل بئر. أضف الخلايا التائية غير الملوثة للوحات تحليل المثلثات. أضف 25 ميكرولتر لكل مليلتر من كوكتيل الأجسام المضادة ل CD3 / CD28 إلى جميع المجموعات باستثناء آبار التحكم السلبية لتحفيز الخلايا التائية واحتضانها حتى اليوم 12. بعد ذلك ، انقل جميع معلقات الخلية من لوحة ثقافة البئر 96 إلى لوحة قاع V مع محلول تلطيخ التدفق. اغسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ التدفق. خصص بعض الخلايا لضوابط التعويض. بعد الغسيل الثاني ، قم بالطرد المركزي للوحة. ثم أضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد المثبط لربط مستقبلات FC المخفف في كل بئر واحتضانه. عند اكتمال الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة للوحة المثلثات المحضرة في كل بئر. لعناصر التحكم في التعويض ، امزج 50 ميكرولترا من خلايا التعويض غير الملوثة مع 50 ميكرولترا من كل جسم مضاد ملون واحد. احتضان اللوحة وأدوات التحكم في التعويض عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم اغسلها بمحلول تلطيخ التدفق قبل الطرد المركزي. الآن قم بتلطيخ الخلايا بصبغة حية / ميتة قريبة من الأشعة تحت الحمراء مخففة في HBSS بمعدل 200 ميكرولتر لكل بئر قبل الحضانة الباردة. اغسل اللوحة وقم بالطرد المركزي قبل تلطيخها باستخدام Fox P3 وتحليل التدفق الخلوي. في اليوم الأول ، كانت الخلايا الوحيدة غير المتمايزة في الغالب HLA-DR-ناقص مع CD14 ناقص صغير ، بينما أظهرت الخلايا الوحيدة المتمايزة في اليوم السابع معظم الخلايا مثل HLA-DR-plus CD14 ناقص ، CD1c-plus ، CD141 plus. أدى العلاج بالرابامايسين مع عديد السكاريد الدهني وبدونه إلى تقليل أعداد DC-SIGN-plus CD1c plus بشكل كبير ومنع تنظيم علامات CD86 و CD40 التي لوحظت مع علاج LPS وحده. زادت مجموعات الخلايا التنظيمية FOX P3-plus T عندما كانت MDCs تشارك في الزراعة مع الخلايا التائية. ولكن لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات العلاج الأربع لوزارة الدفاع الشعبية. تم تقليل تكاثر الخلايا التائية في كل من مجموعات الخلايا التائية CD4 plus و CD8 plus بعد الزراعة المشتركة مع MDOCs المعالجة ب Rapa. زادت العينات المعالجة بالإنترلوكين -10 بشكل كبير من إنتاج إنترلوكين -10 في 24 ساعة. زادت MDOCs المعالجة ب Dex بشكل كبير من إنتاج الإنترلوكين -10 ، ولكن فقط بعد الراحة لمدة 72 ساعة. أدت المعالجة المسبقة للديكساميثازون إلى تقليل متوسط توليد ألفا من عامل نخر الورم عند علاج LPS في 24 ساعة. لوحظت زيادات كبيرة في PDL1 plus MDOCs في المجموعات المعالجة Dex plus LPS و Rapa في 72 ساعة. لوحظ تثبيط تعبير CD86 من جميع المجموعات المعالجة بمعدل المناعة في كل من 24 و 72 ساعة. لم تزيد MDOCs المعالجة بمعدل المناعة من تكاثر الخلايا التائية CD4 plus.