تحليل التعبير والمجمعات لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe

نطاق بحثنا هو ترجمة بروتين الميتوكوندريا ، ونحاول توضيح الآليات التي تؤثر على ترجمة وتجميع مركب سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا. وجد بحثنا أن shy1 يلعب دورا في استدامة الوظيفة المنتظمة للميتوكوندريا من خلال المشاركة في تجميع الحقن الأربعة المعقدة. سيقوم مختبرنا بالتحقيق في آلية ضخ M = الميثوتريكسات.

[الراوي] للبدء ، قم بقياس الوزن الرطب لحبيبات الخلية من الفصام الخميرة بومبي. أعد تعليق الخلايا في ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت S. أضف Dithiothreitol إلى التركيز النهائي البالغ 10 مللي مولار ، وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل إلى مليمولول واحد ، مما يضمن تحضير كلا الكواشف حديثا. أضف الإنزيمات المحللة إلى تعليق الخلية لهضم جدار الخلية لفصام الخميرة بومبي. قم بتدوير الأنبوب على شاكر عند 30 درجة مئوية للمدة الموصى بها للإنزيم المحلل المحدد. استخدم المجهر لمراقبة تكوين البلاستيدات الكروية. ثم قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 1,000 جم ، عند 4 درجات مئوية لحبيبات البلاستيدات الكبروية. أعد تعليق الحبيبات في ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت S البارد. بعد غسلتين ، أعد تعليق البلاستيدات الكروية في ثمانية ملليلتر من محلول التجانس البارد المثلج الذي يحتوي على مثبطات البروتياز. انقل الخليط إلى الخالط الزجاجي المبرد مسبقا الذي يحتوي على مدقة وأنبوب اختبار. تجانس الخلايا ميكانيكيا عن طريق أداء ما يقرب من 15 ضربة لأعلى ولأسفل باستخدام المدقة الضيقة. ثم افحص البلاستيدات الكروية تحت المجهر للتحقق من كسر الغشاء. الآن نقل التعليق المتجانس إلى أنابيب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 1,000 جم عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا غير المنقطعة والحطام. جهاز الطرد المركزي للطافي الناتج لمدة خمس دقائق عند 3,000 جم عند 4 درجات مئوية لحبيبات النوى. ثم انقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الطازجة. جهاز طرد مركزي عند 12,000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لحبيبات الميتوكوندريا والعضيات الأخرى ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للمماسح السوربيتول المثلج EDTA بعد صب المادة الطافية. ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة عند 12,000 جم عند 4 درجات مئوية لغسل الميتوكوندريا. أعد تعليق الحبيبات النهائية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للمماسح المثلجة السوربيتول EDTA. ثم قم بنقل الميتوكوندريا المنقاة في أنابيب التخزين للتجارب المستقبلية. في صفحة SDS تحميل المخزن المؤقت في 40 ميكرولتر من البروتين الكلي للميتوكوندريا. قم بتغيير طبيعة البروتينات عن طريق احتضان الخليط للوقت المحدد في درجة الحرارة المناسبة. قم بتحميل ما يقرب من 20 ميكروغراما أو أربعة ميكرولترات من بروتينات الميتوكوندريا في هلام صفحة SDS بنسبة 12٪ قبل النشاف المناعي. لتحضير العينة لصفحة BN ، أول ميتوكوندريا بيليه من الحصص السابقة عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الميتوكوندريا في 200 ميكرولتر من ثلاثة صفحات جل مؤقت. بعد ذلك، قم بتعبئة ماصتين ميكرولترتين من 100 × فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل وميكرولتر واحد من كلوريد المغنيسيوم المولاري. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة عند 12,000 جم عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في 160 ميكرولتر بوزن 5٪ من حيث حجم الإقامة. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة ، واخلطه برفق كل 10 دقائق. جهاز الطرد المركزي للتعليق لمدة خمس دقائق عند 20,000 جم عند 4 درجات مئوية. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أضف 80 ميكرولترا من ثلاثة مخزن مؤقت لعينة صفحات XBN إلى العينة المعالجة بالإصلاح. أو 32 ميكرولتر إلى العينة المعالجة ب DDM. الآن قم بتجميع المواد الهلامية الأصلية مسبقة الصب Bis-Tris بتدرج 3 إلى 12٪. قم بتحميل عينات البروتين المعالجة جنبا إلى جنب مع علامات البروتين ذات الوزن الجزيئي العالي للرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد الأصلي. قم بتشغيل الجل بجهد ثابت يبلغ 80 فولت ، وتيار ستة مللي أمبير لمدة 30 دقيقة باستخدام عازلة الكاثود التي تحتوي على 0.02٪ Kumasi G250. استبدل المخزن المؤقت بمخزن مؤقت للكاثود بدون كوماسي ، واستمر في العمل عند 10 مللي أمبير لمدة ثلاث ساعات حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل. قطع حارة الجل التي تحتوي على علامة البروتين. قم بتلطيخ العلامة بمخزن Kumasi R250 المؤقت لمدة 15 دقيقة. ثم قم بإزالة البقع حتى تصبح العصابات مرئية. اغمر الجزء المتبقي من الجل في المخزن المؤقت لنقل صفحة BN لمدة 30 دقيقة للتوازن. اشطف غشاء لطخة PVDF 0.45 ميكرومتر بالميثانول ، وتوازن في مخزن النقل لمدة 10 دقائق. انقل البروتينات من الجل إلى غشاء PVDF باستخدام تيار ثابت يبلغ 300 مللي أمبير لمدة ساعتين. اشطف غشاء PVDF بالميثانول لإزالة صبغة كوماسي. ثم احتضان الغشاء في المخزن المؤقت الذي يحجب TBS الذي يحتوي على 5٪ حليب خالي الدسم لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية. احتضان غشاء PVDF بالأجسام المضادة الأولية المحددة ضد مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا الفصامية. بعد حضانة ليلية عند أربع درجات مئوية ، اغسل الغشاء باستخدام عازلة TBST. ثم احتضان الغشاء في الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف من واحد إلى 10,000 لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية. بعد غسل الغشاء باستخدام المخزن المؤقت TBST ، قم بكشف غشاء PVDF ومسحه ضوئيا لتصور نتائج اللطخة المناعية. أدى حذف الجين shy1 إلى انخفاض ملحوظ في مستويات الحالة المستقرة لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي المشفرة للحمض النووي للميتوكوندريا ، Cob1 و Cox1 و Cox2 و Cox3 و Atp6. أظهر تحليل الصفحة الأصلية الزرقاء أن وفرة المجمعات الفائقة لسلسلة الجهاز التنفسي القابلة للذوبان DG 3242 و 324 قد انخفضت في خلايا دلتا خجولة. بينما ظلت مستويات المجمعات الفائقة 32.=، و 55N غير متأثرة. لم يتغير مستوى المركب القطري المذاب DDM 3 في سلالة دلتا shy1.