Analysis of the Expression and Complexes Assembly of the Mitochondrial Respiratory Chain Proteins in the Fission Yeast <em>Schizosaccharomyces pombe</em>

Guangchun Lu; Jinjie Shang; Gang Feng

doi:10.3791/68336

تحليل التعبير والمجمعات لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في الخميرة الانشطارية Sc...

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biochemistry

Analysis of the Expression and Complexes Assembly of the Mitochondrial Respiratory Chain Proteins in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

تحليل التعبير والمجمعات لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe

Full Text

1,044 Views

08:07 min

May 2, 2025

DOI: 10.3791/68336-v

Guangchun Lu¹, Jinjie Shang¹, Gang Feng¹

¹Jiangsu Key Laboratory for Pathogens and Ecosystems, College of Life Sciences,Nanjing Normal University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study focuses on the fission yeast Schizosaccharomyces pombe as a model organism for mitochondrial research. It details a protocol for analyzing mitochondrial respiratory complexes, highlighting the role of the shy1 gene in mitochondrial function.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Mitochondrial Research

Background

Schizosaccharomyces pombe is a valuable model for studying mitochondria.
Mitochondrial respiratory complexes are crucial for cellular energy production.
Understanding gene functions in mitochondrial assembly can reveal insights into metabolic processes.
The shy1 gene is implicated in the assembly of respiratory chain complexes.

Purpose of Study

To analyze the abundance and assembly of mitochondrial respiratory complexes in S. pombe.
To investigate the role of the shy1 gene in mitochondrial function.
To develop a protocol for studying mitochondrial protein translation.

Methods Used

Cell pellet preparation and spheroplast formation.
Centrifugation to isolate mitochondria and other organelles.
Protein denaturation and loading for SDS-PAGE and BN-PAGE.
Immunoblotting to analyze mitochondrial respiratory chain proteins.

Main Results

Deletion of the shy1 gene reduced levels of mitochondrial DNA-encoded respiratory chain proteins.
Blue native PAGE analysis showed decreased abundance of specific respiratory chain supercomplexes in Delta shy1 cells.
Complex 3 levels remained unchanged in the Delta shy1 strain.
The study provides insights into the mechanisms of mitochondrial protein assembly.

Conclusions

Shy1 is essential for maintaining mitochondrial respiratory chain function.
The developed protocol can be used for further studies on mitochondrial dynamics.
Understanding mitochondrial assembly can have implications for metabolic research.

Frequently Asked Questions

What is the significance of Schizosaccharomyces pombe in mitochondrial research?

Schizosaccharomyces pombe serves as an effective model organism for studying mitochondrial functions and dynamics due to its genetic tractability.

How does the shy1 gene affect mitochondrial function?

The shy1 gene is involved in the assembly of mitochondrial respiratory chain complexes, and its deletion leads to reduced levels of essential proteins.

What methods were used to analyze mitochondrial proteins?

The study utilized SDS-PAGE and BN-PAGE techniques, followed by immunoblotting to assess protein levels and complex formation.

What were the main findings regarding respiratory chain supercomplexes?

The study found that specific supercomplexes were reduced in the absence of the shy1 gene, indicating its role in mitochondrial assembly.

What future research directions does this study suggest?

Future research may focus on elucidating the detailed mechanisms of mitochondrial protein translation and the role of other genes in respiratory chain assembly.

تظهر الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe كنموذج جذاب لدراسة الميتوكوندريا. هنا ، نصف بروتوكولا لتحليل وفرة وتجميع مجمعات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في S. pombe. يتيح ذلك توصيف الوظائف الجديدة للجينات المحفوظة في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا.

نطاق بحثنا هو ترجمة بروتين الميتوكوندريا ، ونحاول توضيح الآليات التي تؤثر على ترجمة وتجميع مركب سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا. وجد بحثنا أن shy1 يلعب دورا في استدامة الوظيفة المنتظمة للميتوكوندريا من خلال المشاركة في تجميع الحقن الأربعة المعقدة. سيقوم مختبرنا بالتحقيق في آلية ضخ M = الميثوتريكسات.

[الراوي] للبدء ، قم بقياس الوزن الرطب لحبيبات الخلية من الفصام الخميرة بومبي. أعد تعليق الخلايا في ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت S. أضف Dithiothreitol إلى التركيز النهائي البالغ 10 مللي مولار ، وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل إلى مليمولول واحد ، مما يضمن تحضير كلا الكواشف حديثا. أضف الإنزيمات المحللة إلى تعليق الخلية لهضم جدار الخلية لفصام الخميرة بومبي. قم بتدوير الأنبوب على شاكر عند 30 درجة مئوية للمدة الموصى بها للإنزيم المحلل المحدد. استخدم المجهر لمراقبة تكوين البلاستيدات الكروية. ثم قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 1,000 جم ، عند 4 درجات مئوية لحبيبات البلاستيدات الكبروية. أعد تعليق الحبيبات في ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت S البارد. بعد غسلتين ، أعد تعليق البلاستيدات الكروية في ثمانية ملليلتر من محلول التجانس البارد المثلج الذي يحتوي على مثبطات البروتياز. انقل الخليط إلى الخالط الزجاجي المبرد مسبقا الذي يحتوي على مدقة وأنبوب اختبار. تجانس الخلايا ميكانيكيا عن طريق أداء ما يقرب من 15 ضربة لأعلى ولأسفل باستخدام المدقة الضيقة. ثم افحص البلاستيدات الكروية تحت المجهر للتحقق من كسر الغشاء. الآن نقل التعليق المتجانس إلى أنابيب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 1,000 جم عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا غير المنقطعة والحطام. جهاز الطرد المركزي للطافي الناتج لمدة خمس دقائق عند 3,000 جم عند 4 درجات مئوية لحبيبات النوى. ثم انقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الطازجة. جهاز طرد مركزي عند 12,000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لحبيبات الميتوكوندريا والعضيات الأخرى ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للمماسح السوربيتول المثلج EDTA بعد صب المادة الطافية. ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة عند 12,000 جم عند 4 درجات مئوية لغسل الميتوكوندريا. أعد تعليق الحبيبات النهائية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للمماسح المثلجة السوربيتول EDTA. ثم قم بنقل الميتوكوندريا المنقاة في أنابيب التخزين للتجارب المستقبلية. في صفحة SDS تحميل المخزن المؤقت في 40 ميكرولتر من البروتين الكلي للميتوكوندريا. قم بتغيير طبيعة البروتينات عن طريق احتضان الخليط للوقت المحدد في درجة الحرارة المناسبة. قم بتحميل ما يقرب من 20 ميكروغراما أو أربعة ميكرولترات من بروتينات الميتوكوندريا في هلام صفحة SDS بنسبة 12٪ قبل النشاف المناعي. لتحضير العينة لصفحة BN ، أول ميتوكوندريا بيليه من الحصص السابقة عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الميتوكوندريا في 200 ميكرولتر من ثلاثة صفحات جل مؤقت. بعد ذلك، قم بتعبئة ماصتين ميكرولترتين من 100 × فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل وميكرولتر واحد من كلوريد المغنيسيوم المولاري. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة عند 12,000 جم عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في 160 ميكرولتر بوزن 5٪ من حيث حجم الإقامة. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة ، واخلطه برفق كل 10 دقائق. جهاز الطرد المركزي للتعليق لمدة خمس دقائق عند 20,000 جم عند 4 درجات مئوية. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أضف 80 ميكرولترا من ثلاثة مخزن مؤقت لعينة صفحات XBN إلى العينة المعالجة بالإصلاح. أو 32 ميكرولتر إلى العينة المعالجة ب DDM. الآن قم بتجميع المواد الهلامية الأصلية مسبقة الصب Bis-Tris بتدرج 3 إلى 12٪. قم بتحميل عينات البروتين المعالجة جنبا إلى جنب مع علامات البروتين ذات الوزن الجزيئي العالي للرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد الأصلي. قم بتشغيل الجل بجهد ثابت يبلغ 80 فولت ، وتيار ستة مللي أمبير لمدة 30 دقيقة باستخدام عازلة الكاثود التي تحتوي على 0.02٪ Kumasi G250. استبدل المخزن المؤقت بمخزن مؤقت للكاثود بدون كوماسي ، واستمر في العمل عند 10 مللي أمبير لمدة ثلاث ساعات حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل. قطع حارة الجل التي تحتوي على علامة البروتين. قم بتلطيخ العلامة بمخزن Kumasi R250 المؤقت لمدة 15 دقيقة. ثم قم بإزالة البقع حتى تصبح العصابات مرئية. اغمر الجزء المتبقي من الجل في المخزن المؤقت لنقل صفحة BN لمدة 30 دقيقة للتوازن. اشطف غشاء لطخة PVDF 0.45 ميكرومتر بالميثانول ، وتوازن في مخزن النقل لمدة 10 دقائق. انقل البروتينات من الجل إلى غشاء PVDF باستخدام تيار ثابت يبلغ 300 مللي أمبير لمدة ساعتين. اشطف غشاء PVDF بالميثانول لإزالة صبغة كوماسي. ثم احتضان الغشاء في المخزن المؤقت الذي يحجب TBS الذي يحتوي على 5٪ حليب خالي الدسم لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية. احتضان غشاء PVDF بالأجسام المضادة الأولية المحددة ضد مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا الفصامية. بعد حضانة ليلية عند أربع درجات مئوية ، اغسل الغشاء باستخدام عازلة TBST. ثم احتضان الغشاء في الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف من واحد إلى 10,000 لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية. بعد غسل الغشاء باستخدام المخزن المؤقت TBST ، قم بكشف غشاء PVDF ومسحه ضوئيا لتصور نتائج اللطخة المناعية. أدى حذف الجين shy1 إلى انخفاض ملحوظ في مستويات الحالة المستقرة لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي المشفرة للحمض النووي للميتوكوندريا ، Cob1 و Cox1 و Cox2 و Cox3 و Atp6. أظهر تحليل الصفحة الأصلية الزرقاء أن وفرة المجمعات الفائقة لسلسلة الجهاز التنفسي القابلة للذوبان DG 3242 و 324 قد انخفضت في خلايا دلتا خجولة. بينما ظلت مستويات المجمعات الفائقة 32.=، و 55N غير متأثرة. لم يتغير مستوى المركب القطري المذاب DDM 3 في سلالة دلتا shy1.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos